MALAT-1沉默对膀胱癌细胞增殖、凋亡及caspase-3表达的影响

王 阳 曹志华 刘 磊 谷傲铮

膀胱癌是世界范围内第五大常见的肿瘤，也是泌尿外科最常见的恶性肿瘤之一[1，2]。近年来随着生活节奏的加快，膀胱癌发生率在我国呈逐年上升趋势，其中，城市人口发生率高于农村[3，4]。膀胱癌在组织学分类中主要有尿路上皮细胞癌、鳞状细胞癌和腺细胞癌等，其中，以尿路上皮细胞癌最为常见[5，6]。目前临床上对于膀胱癌的治疗以手术切除为主，但预后性较差，且有较高的恶化和转移风险，而且，膀胱癌初期症状比较隐匿，容易被忽视，很多患者诊断出来时就已是中晚期[7，8]。因此，寻找更精确有效的膀胱癌诊断、筛查、治疗靶点，是治疗膀胱癌的当务之急。

肺癌转移相关转录本1(MALAT-1)是非编码RNA——lncRNA家族的一员[9]，有研究证明其在多种恶性肿瘤上表达丰富，并与多种恶性肿瘤的发生、发展、转移有密切联系，可以作为肿瘤早期诊断的指标，也可能成为将来肿瘤治疗的一个潜在靶点[10，11]。尽管已有报道证实MALAT-1与多种肿瘤密切相关，但对膀胱肿瘤细胞行为的影响尚未有大量报道。因此，本研究旨在探讨MALAT-1在正常膀胱组织和膀胱癌组织中表达的差异，及MALAT-1对膀胱癌EJ细胞增殖、凋亡的影响，及其可能存在的作用机制。

材料与方法

1.临床标本采集:(1)膀胱癌组织：来源于2017年1月～2017年10月期间于笔者医院泌尿外科行膀胱癌手术切除，并经病理检验确诊为尿路上皮癌的患者，共16例，其中男性9例，女性7例，患者年龄45～68岁，平均年龄56.68±10.39岁，16例患者在手术前均未经过放射治疗或化学治疗。另收集16例远离肿瘤组织至少3cm以上的癌旁组织，且经病理诊断为正常膀胱组织，其中男性患者8例，女性患者8例，患者年龄43～70岁，平均年龄58.05±12.11岁，16例患者在手术前均未经过放射治疗或化学治疗。标本离体后立即投入液氮保存。本研究经过笔者医院伦理学委员会批准，患者均签署知情同意书。(2)细胞株：人膀胱癌EJ细胞系购自上海榕柏生物技术有限公司。(3)试剂：含双抗的1640培养基，胎牛血清(上海Gibco公司)；Trizol、反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；caspase-3引物由上海生工生物工程有限公司合成；MALAT-1抗体、GAPDH抗体(上海艾博抗贸易有限公司)；RNAi MAX 转染试剂(美国 Invitrogen公司)；MALAT-1-si RNA合成(苏州吉玛基因股份有限公司)；CCK-8试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)；TUNEL免疫荧光检测试剂盒(兔)(北京中杉金桥生物技术有限公司)。(4)仪器:恒温细胞培养箱(国营创新医疗器械厂)；电子天平(北京市六一仪器厂)；酶标仪(美国BIO-RAD公司)；高速离心机(北京兴联商贸有限公司)；DYC-p32型电泳槽(北京市六一仪器厂)；Lecia DC300F显微照像系统(德国Lecia公司)。

2.实验步骤:(1)RT-PCR检测膀胱癌组织及正常膀胱组织中MALAT-1基因的表达:将冻存的组织剪成小块，用Trizol从组织中提取总RNA，进行反转录反应。取2μl RNA进行PCR扩增：内参为GAPDH，内参引物序列：Sense：5′-CAGGTAGCTACGGTAACGTACT-3′；Antisene：5′-ATCGATCGATACTTCGGGTTAA-3′。MALAT-1mRNA的引物序列：Sense：5′-CAGACTAGCATTAGCGCATTG-3′；Antisense：5′-CAGGGCATGCCATTGCCTGA-3′；扩增条件如下：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃总延伸6min。取5μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳条带，分析目的基因和参比基因的条带灰度值。(2)体外实验：①细胞复苏及传代:将人膀胱癌EJ细胞复苏重悬后，转移至含双抗和10%FBS的1640培养基中，于恒温培养箱中传代，取2～3次传代后的细胞用于下一步操作；②细胞转染:将RNAiMAX与MALAT-1-si RNA分别用不含FBS的Opti-MEM I培养基稀释后混合，室温下孵育20min以形成复合物，将该复合物加入到接种含有人膀胱癌EJ细胞但不含FBS培养基的6孔板中，细胞密度为8×104/孔，轻晃培养板使其混合均匀。在37℃、5%CO2环境中孵育24h后，更换含有10%FBS的培养基，继续培养，构建MALAT-1沉默及MALAT-1正常表达的人膀胱癌EJ细胞系；③CCK-8比色试验检测细胞增殖:将MALAT-1沉默及MALAT-1正常表达的人膀胱癌EJ细胞分别转移至96孔板中，每孔内细胞浓度调整至2×103/100μl，并在培养板四周设置只含有培养基不含细胞的空白对照孔。将两组细胞培养适当时间(36、48、72h，各时间点包含6个复孔)后，在各时间段结束时快速向孔中加入10μl的CCK-8溶液，将96孔板在培养箱中继续孵育4h，用酶标仪检测每孔细胞悬液在450nm波长处的吸光度(A)，计算细胞生长抑制率；④TUNEL免疫荧光法检测细胞凋亡:将MALAT-1沉默及MALAT-1正常表达的细胞培养适当的时间(36、48、72h，各时间点包含6个复孔)后，用PBS洗涤，4%多聚甲醛固定30min后PBS洗涤，加入含0.1%TritonX-100的PBS在冰浴条件下孵育2min，然后加入TUNEL检测液，室温下避光孵育1h，在荧光显微镜下观察TUNEL阳性细胞数;⑤Western blot法检测细胞中caspase-3蛋白表达：将MALAT-1沉默及MALAT-1正常表达的细胞培养72h后，蛋白裂解液冰浴中裂解，离心后取上清液，经SDS-PAGE电泳条件分离蛋白，将蛋白转移至NC膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭孵育NC膜，按顺序加入一抗、二抗，TBST洗涤NC膜，ECL显色，将胶片扫描后用Bandscan5.0软件进行灰度分析。

结 果

在正常膀胱组织中，MALAT-1基因条带灰度值为0.193±0.026，膀胱癌组织中，MALAT-1基因条带灰度值为0.395±0.059，显著高于正常膀胱组织(P<0.05),详见图1。

图1 RT-PCR检测正常膀胱组织及膀胱癌组织中MALAT-1的表达与正常膀胱组织比较，*P<0.05

MALAT-1正常表达和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ细胞经培养36h后，MALAT-1正常表达的细胞抑制率为6.44%±0.25%，MALAT-1沉默的细胞抑制率为11.03%±0.87%，显著高于MALAT-1正常表达的细胞(P=0.000)；经培养48h后，MALAT-1正常表达的细胞抑制率为5.87%±1.35%，MALAT-1沉默的细胞抑制率为9.47%±1.74%，显著高于MALAT-1正常表达的细胞(P=0.000)；经培养72h后，MALAT-1正常表达的细胞抑制率为5.58%±1.03%，MALAT-1沉默的细胞抑制率为8.57%±2.01%，显著高于MALAT-1正常表达的细胞(P=0.000),详见表1。

MALAT-1正常表达和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ细胞经培养36h后，在显微镜相同视野下，MALAT-1正常表达细胞TUNEL阳性细胞数为9.37±2.19，MALAT-1沉默细胞TUNEL阳性细胞数为17.62±4.23，显著高于MALAT-1正常表达细胞(P<0.05)；经培养48h后，MALAT-1正常表达细胞TUNEL阳性细胞数为18.96±4.39， MALAT-1沉默细胞TUNEL阳性细胞数为31.74±6.43，显著高于MALAT-1正常表达细胞(P<0.05)；经培养72h后，MALAT-1正常表达细胞TUNEL阳性细胞数为32.57±5.33，MALAT-1沉默细胞TUNEL阳性细胞数为58.06±6.92，显著高于MALAT-1正常表达细胞(P<0.05),详见图2。

表1 MALAT-1正常表达和MALAT-1沉默的细胞培养不同时间后的生长抑制情况

图2 MALAT-1正常表达和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ细胞培养不同时间后TUNEL染色图示及数据与MALAT-1正常表达细胞比较，*P<0.05

MALAT-1正常表达和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ细胞培养72h后，MALAT-1沉默细胞caspase-3蛋白条带灰度值为0.754±0.082，MALAT-1正常表达细胞caspase-3蛋白条带灰度值为0.316±0.088，显著低于MALAT-1沉默细胞(P<0.05)，详见图3。

图3 Western blot法检测MALAT-1正常表达和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ细胞中caspase-3的表达与MALAT-1正常表达比较，*P<0.05

讨 论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，对人类的健康造成了极大的威胁[1～3]。由于膀胱癌早期症状不明显，且临床上对膀胱癌的早期诊断尚未找到敏感合适的指标，以至于很多患者诊断出膀胱癌时已是中晚期[4,5]。此外，临床上对膀胱癌的治疗以手术切除为主，但易复发，易转移，预后较差，并不能从根本上改善患者的生存质量，因此，寻找敏感且有效的靶向指标，是早期诊断、有效治疗膀胱癌的当务之急[12，13]。

肺癌转移相关转录本1(MALAT-1)是一个长约8000nt的非编码RNA，首次在肺癌组织中被发现[10，11]。其在人类多种组织中广泛表达，尤其在肿瘤组织中的表达异常丰富[15，16]。有研究报道，MALAT-1能参与胃癌、胰腺癌、宫颈癌等肿瘤细胞的生物学活动，调控其增殖、凋亡和迁移[16～20]，但对MALAT-1在膀胱癌组织及细胞中的作用尚未有大肆报道。本实验检测了人正常膀胱组织和膀胱尿路上皮癌组织中MALAT-1基因的表达，MALAT-1基因在膀胱尿路上皮癌组织中的表达显著高于正常膀胱组织，此结果提示MALAT-1在膀胱尿路上皮癌的发病过程中可能起到了重要作用。

为了进一步探讨MALAT-1在膀胱癌细胞行为中所扮演的角色，本研究拟沉默MALAT-1观察其对膀胱癌细胞增殖和凋亡所造成的影响，通过用MALAT-1-si RNA转染人膀胱癌EJ细胞，构建MALAT-1沉默细胞系，用CCK-8法检测其与MALAT-1正常表达细胞系增殖能力的差异，结果显示，MALAT-1正常表达和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ细胞经培养36h后，MALAT-1正常表达细胞抑制率为6.44%±0.25%，MALAT-1沉默细胞抑制率为11.03%±0.87%，显著高于MALAT-1正常表达细胞(P=0.000)；经培养48h后，MALAT-1正常表达细胞抑制率为5.87%±1.35%，MALAT-1沉默细胞抑制率为9.47%±1.74%，显著高于MALAT-1正常表达细胞(P=0.000)；经培养72h后，MALAT-1正常表达细胞抑制率为5.58%±1.03%，MALAT-1沉默细胞抑制率为8.57%±2.01%，显著高于MALAT-1正常表达细胞(P=0.000)，上述结果表明MALAT-1沉默可提高膀胱癌EJ细胞抑制率，提示MALAT-1参与了膀胱癌细胞的增殖过程，且具有一定的促进作用。

与此同时，本研究检测了MALAT-1正常表达和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ细胞的凋亡，在培养36、48和72h时间点检测结果均显示，在相同视野范围内，MALAT-1沉默细胞中TUNEL阳性细胞数均显著高于MALAT-1正常表达细胞，上述结果提示MALAT-1沉默对人膀胱癌EJ细胞具有一定的促凋亡作用，可见MALAT-1不仅能促进膀胱癌细胞的增值能力，且对癌细胞的凋亡具有一定的抑制作用。

caspase-3是细胞凋亡过程各凋亡途径的枢纽，也是最重要、最直接的调控因子[10,20]。为了进一步探讨MALAT-1抑制膀胱癌细胞凋亡可能相关的作用机制，本研究将 MALAT-1正常表达和MALAT-1沉默的人膀胱癌EJ细胞培养72h后，检测caspase-3蛋白在两组细胞中的表达。结果显示，MALAT-1沉默细胞caspase-3蛋白表达量显著高于MALAT-1正常表达细胞，表明随着MALAT-1基因表达被抑制，人膀胱癌细胞中caspase-3被激活，说明MALAT-1对caspase-3的表达具有抑制作用，而其对膀胱癌细胞凋亡的抑制作用可能正是由于抑制了caspase-3的表达。

综上所述，MALAT-1在膀胱癌组织中的表达被激活，同时，MALAT-1能促进膀胱癌细胞的增殖，抑制膀胱癌细胞的凋亡，这种抑制作用可能是通过直接调控caspase-3的表达而实现的。此外，上述实验结论提示MALAT-1可能在膀胱癌的发病过程中发挥了重要作用，并可能成为膀胱癌早期诊断、有效治疗的一个新的作用靶点。