血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平在乳腺癌中的临床病理学意义及预后价值

罗俊波 郑瑞锋 王彦威 文海英 庄红丽

乳腺癌是当今危害女性健康的第一大肿瘤，其发病率居女性恶性肿瘤之首[1]。目前我国乳腺癌发病率为21.6/10万，较10年前增长了近一倍[2]。近年来随着医疗水平的提高，乳腺癌的总体5年生存率有所提高，但某些分子类型乳腺癌的预后仍不尽如人意，尤其是基底细胞型乳腺癌[3]。乳腺癌的预后取决于其分子类型与TNM分期，寻找可靠、稳定且无创的早期筛查指标无疑可为乳腺癌患者的治疗赢得时间，对预后具有重要意义。近年来，关于基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)在恶性肿瘤中也有重要发现[4-5]。MMP-2和MMP-9是一类重要的水解细胞外基质的蛋白水解酶，参与到肿瘤的生长与转移过程。Chan等[4]运用免疫组化技术在939例膀胱癌患者组织中同样发现，与癌旁组织相比，癌组织中MMP-2的表达显著升高，且MMP-2高表达者预后更差。Shi等[5]发现，与健康女性相比，子宫内膜癌患者血清MMP-9水平显著增高，且与淋巴结转移相关。

本研究通过对60例乳腺癌患者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平进行分析，旨在探究三者与乳腺癌临床病理特征之间的关系及在乳腺癌患者预后评估中的价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1月至2016年1月期间入我院就诊的乳腺癌患者60例，所有患者均经病理学确诊。乳腺癌分子分型的依据来自术中切除的肿瘤组织的免疫组化结果。乳腺癌的分期参照美国肿瘤联合会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第8版乳腺癌分期系统[6]，其中Luminal A 型19例、Luminal B型 16例、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor2，HER2)过表达型11例、基底细胞型14例，Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌38例、Ⅲ～Ⅳ乳腺癌22例。同期选取健康体检者80例。乳腺癌患者纳入标准：①意识清楚，语言表达能力正常，能与调查人员进行正常的沟通；②与研究者进行研究目的沟通后，研究对象自愿参与本研究；排除标准：①已在外院接受放化疗或免疫治疗者；②急慢性感染、甲状腺疾病、其他的良恶性肿瘤者；③患者或其家属不愿意签署知情同意书者。从患者入院开始对纳入的60例乳腺癌患者进行随访，随访日期截止至2017年9月，随访时间为16～40个月。本研究的开展经医院伦理委员会批准，所有纳入对象均签署了项目知情同意书。

1.2 临床资料采集

由专业人员收集所有纳入对象的临床资料如：年龄、吸烟史、饮酒史、体重指数(BMI)等，BMI计算方法为体重/身高2(kg/m2)。

1.3 临床样本采集与检测方法

使用含促凝剂采血管抽取乳腺癌患者治疗前及健康体检者静脉血10 ml。血清CA15-3的检测采用化学发光法，试剂由上海百蕊生物科技有限公司提供，采用美国贝克曼库尔特公司UniCel DxI 800分析仪进行检测。质控品采用英国朗道公司肿瘤高、低值质控品，质控判断标准为Westgard多规则分析。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测每组对象血清MMP-2和MMP-9水平，试剂盒由武汉博士德生物工程公司提供，检测过程严格按照试剂盒说明进行，简明步骤如下：所有标本经稀释(1∶100)后依次加入微孔板中与抗体室温孵育40 min(分别加入MMP-2浓度为200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、10 pg/mL的4个标准品、阳性和阴性对照，MMP-9浓度为100 pg/mL、50 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL的4个标准品、阳性和阴性对照)，洗板5次，在避光条件下加入酶标记的单抗室温孵育40 min，再洗板5次，加入底物反应15 min后终止反应，于Nanodrop ND2000分析仪(美国赛默飞世尔公司)上检测吸光值(A)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 临床基本信息

所有研究对象的临床基本信息，见表1。乳腺癌患者和健康体检者之间在年龄、吸烟史、饮酒史、糖尿病史和BMI方面的差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2.2 研究对象血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平比较

乳腺癌患者和健康体检者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平，见表2。与健康组相比，乳腺癌患者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平均增高，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 60例乳腺癌患者和80例健康体检者的临床基本信息

表2 60例乳腺癌患者和80例健康体检者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平

2.3 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平与乳腺癌临床病理特征的关系

如表3所示，乳腺癌患者血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平与乳腺癌患者年龄、BMI、吸烟与否、饮酒与否等无显著关系(P>0.05)，而与肿瘤的分子分型(与血清MMP-2、MMP-9和CA15-3的R2分别为0.296、0.285、0.283，P<0.001)、TNM分期(与血清MMP-2、MMP-9和CA15-3的R2分别为0.310、0.276、0.303，P<0.001)显著相关。血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平在基底样型乳腺癌患者中的增高最为明显，其次为HER2阳性型。此外，三者在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者中的水平显著高于Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者(P<0.05)。

2.4 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3对乳腺癌的风险评估

多元Logistic回归分析结果，见表4。单因素分析显示，MMP-2、MMP-9和CA15-3是乳腺癌的危险因素；多因素分析显示，在校正年龄、吸烟、饮酒、糖尿病等因素影响后，MMP-2、MMP-9和CA15-3高表达是乳腺癌的独立危险因素。

表3 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平与乳腺癌临床病理特征间的关系

表4 血清MMP-2、MMP-9和CA15-3等指标对乳腺癌的预测价值

注：a校正年龄、吸烟、饮酒、糖尿病等因素影响。

2.5 生存分析

60例乳腺癌患者依据MMP-2、MMP-9和CA15-3水平的中位数分别被分为高MMP-2与低MMP-2组、高MMP-9与低MMP-9组和高CA15-3与低CA15-3组。同低MMP-2组相比，高MMP-2组患者的生存时间显著降低(log-rankP=0.026，图1A)；同低MMP-9组相比，高MMP-9组患者的生存时间显著降低(log-rankP=0.012，图1B)而高CA15-3与低CA15-3组间的生存时间差异无统计学意义(log-rankP=0.563，图1C)。

图1 生存分析

3 讨论

依据2012年国家癌症中心数据显示，我国乳腺癌总发病率约为43/10万，其中城市为52/10万，农村为23/10万[7-8]。近年来，虽然乳腺癌的死亡率在逐年下降，但其发病率却在逐年升高。目前临床上乳腺癌的诊断主要依赖于乳腺X线摄影、超声和实验室肿瘤标记物指标，然而都存在着敏感性低、特异度不高等问题。乳腺癌的早期发现与诊断，是改善患者预后，提高生存率的有效方法。目前，乳腺X线摄影检出乳腺癌敏感度为70%～75%，特异度约为65%，而超声的敏感性和特异性均只有近60%[9]。因此，临床上迫切需要找寻具有更高敏感性、特异度的生物标记物。

实验室诊断乳腺癌的指标主要是CA15-3，而其敏感性只有约55%[10]。近年来国内外多个研究报道指出血清MMP-2和MMP-9在重塑肿瘤微环境、促进肿瘤远处转移、以及在肿瘤诊断及预后等评价中具有积极的价值[11-14]。MMP-2和MMP-9是一类重要的水解细胞外基质的蛋白水解酶，参与到肿瘤的生长与转移过程。近年研究发现，一些肿瘤相关巨噬细胞可以通过旁分泌途径释放MMP-2和MMP-9。Jiang等[11]发现胃癌细胞中过表达钙粘蛋白17可以显著提高癌细胞释放MMP-2，而MMP-2可通过NF-κB通路促进癌细胞的增殖，并与患者预后不良相关。此外，Xu等[12]运用实时荧光定量聚合酶链反应分析发现，与健康人相比胃癌患者血浆MMP-2基因的表达显著升高。在子宫内膜癌研究中，Zhang[13]发现通过下调子宫内膜癌细胞中MMP-9可降低四氢大麻醇的表达，进而抑制癌细胞的侵袭和转移。Pietruszewska等[14]应用免疫组化技术在210例头颈部癌患者组织中同样发现，与癌旁组织相比癌组织中MMP-2与MMP-9水平显著增高，且与淋巴结转移相关(P<0.05)。然而，关于血清MMP-2和MMP-9对乳腺癌预后评估的临床价值相关研究未见报道。因此，本研究我们通过对60例确诊为乳腺癌患者外周血MMP-2和MMP-9进行分析并随访，同时结合乳腺癌相关肿瘤标记物CA15-3，旨在探讨血清MMP-2、MMP-9和CA15-3在乳腺癌患者预后评估中的价值。

本研究我们发现，与健康组相比，乳腺癌患者血清CA15-3、MMP-2和MMP-9水平均显著增高，且血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平在基底样型乳腺癌患者中的增高最为明显，其次为HER2阳性型。此外，三者在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌患者中的水平显著高于Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者。基底样型乳腺癌是恶性程度最高的一类，MMP-2、MMP-9和CA15-3水平的显著提高提示三者在该亚型患者肿瘤发展中起重要作用。相关性分析显示血清MMP-2、MMP-9和CA15-3水平与肿瘤的分子分型、TNM分期显著相关，与前期多个学者在其他肿瘤中的发现相一致[11，13-14]，提示MMP-2、MMP-9和CA15-3可能参与乳腺癌的进程中。多因素分析显示，在校正年龄、吸烟、饮酒、糖尿病等因素影响后，高MMP-2、高MMP-9和高CA15-3是乳腺癌的独立危险因素。最后，我们进行了指标的预后评估，发现高MMP-2组和高MMP-9组患者的生存时间显著短于低MMP-2组和低MMP-9组患者，而血清高CA15-3与低CA15-3组间的生存时间差异无统计学意义，提示乳腺癌患者血清MMP-2和MMP-9水平在评估患者预后中具有潜在价值。然而，本次研究仍有如下不足：①本次研究纳入的患者均来自于本院，这可能会对研究结果造成一定的偏倚影响，今后需要多中心的队列研究来进一步验证我们的结果；②本研究纳入60例乳腺癌患者，例数有限，后期需要更大样本量的研究来证实血清MMP-2、MMP-9和CA15-3对我国乳腺癌患者的临床价值。

通过本次实验，我们发现血清MMP-2和MMP-9在评估乳腺癌患者预后中具有重要的临床意义，有望为临床乳腺癌患者的诊疗及预后改善提供新的途径与思路。