女贞子乙醇提取物对人毛囊无色素黑素细胞c-kit表达的影响

（1.河南科技大学第一附属医院 皮肤科，河南 洛阳，471000；2.洛阳市第二中医院皮肤科，河南 洛阳，471003）

白癜风是皮肤科常见多发难治性色素障碍性疾病，严重影响患者皮肤外观美容，导致患者极大的精神压力和沉重的经济负担。白癜风的病因和发病机制十分复杂，至今仍未明确[1]。目前西医治疗白癜风方法很多，如光化学疗法，免疫疗法、自体表皮移植及黑素细胞移植等[2]，但疗效不理想或有一定副作用，存在着较大的局限性。相比之下，某些中药制剂在白癜风治疗方面已取得了令人满意的效果 ，但具体作用机制研究较少。女贞子具有滋补肝肾，明目乌发的功能。药理研究表明女贞子具有护肝、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老等作用[3]，还可上调酪氨酸酶活性，促进黑素合成。干细胞因子(SCF)及其受体c-kit对黑素细胞的分化、增殖、迁移具有重要作用。前期研究显示，与正常对照组相比，白癜风皮损毛囊无色素黑素细胞（AMMC）上c-kit表达显著减少，提示白癜风皮损毛囊SCF/c-kit信号通路可能存在异常受损从而致黑素细胞功能失调[4]。鉴于此，本研究旨在探讨女贞子乙醇提取物对人毛囊无色素黑素细胞c-kit表达的影响，并以此为切入点，探讨白癜风的治疗新途径。

1 试剂与材料

1.1 研究材料

皮肤标本取自人正常头皮(河南科技大学第一附属医院急诊外科提供)，4℃环境下以DMEM培养基贮存，贮存时间不超过48h。

1.2 主要研究试剂

兔抗人酪氨酸激酶受体抗体、B-actin抗体、鼠抗人T311酪氨酸酶单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)；0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(杭州吉诺)，中性蛋白分离酶(dispase)(广州威佳)，M254培养基、人黑素细胞生长添加剂(HMGS)、Transwell培养板(美国Cascade)，即用型SP免疫组化试剂盒(福建迈新)，RNase(上海瑞齐)，琼脂糖凝胶(上海艾研)，Trizol(美国Invitrogen公司)。

2 方 法

2.1 中药提取

参照李永伟等[5]制定的方法。

2.2 毛囊无色素黑素细胞培养

参照王大光等[6]制定的方法进行。

2.3 细胞增殖

参照李永伟[7]方法，配制0，2，0.67，0.22，0.07，0.03 mg／mL含女贞子乙醇提取物浓度的TICVA培养基。无色素黑素细胞用dispase酶消化传代后第2天加入所配培养基于24孔培养板培养，每个浓度设4个复孔，72 h后Coulter Counter计数，确定最佳浓度。然后加入现配XTY/PMS显色液，490 nm波长下检测各孔吸光度(A值)。

2.4 c-kit 表达

以每孔1×105个，将培养液接种于6孔培养板，37℃环境下培养24 h后，去除上清，加入女贞子提取物，培养72 h终止。同时设立空白对照组，仅添加M254完全培养基。设计PCR引物[8]，RT-PCR测定c-kit mRNA的相对表达量。

2.5 统计方法

采用SPSS23.0软件，采用重复测量方差分析或独立样本 检验， P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞增殖

重复测量方差分析结果显示，培养72h后，浓度为2，0.67，0.22，0.07，0.03 mg／mL女贞子乙醇提取物对毛囊无色素黑素细胞的增殖具有促进作用(F=9.34，P＜0.01)，其中0.22mg/mL促进作用最为显著(P＜0.05)。见表1。

表1 不同浓度女贞子提取物对毛囊无色素黑素细胞的促增殖作用(n=10)

3.2 c-kit表达

对照组c-kit mRNA表达值为(0.125±0.023)，而0.22mg/mL组为(0.647±0.046)，组间比较差异有统计学意义(n=10， =-32.096，P＜0.001)。

4 讨 论

祖国医学认为，白癜风病因病机主要为“肝肾不足”，肝肾不足则“皮毛膝里失养而发白斑”，因此临床多采用“补益肝肾”法治疗。女贞子具有滋补肝肾，明目乌发的功能，其主要有效成分为酪醇和齐墩果酸，其中酪醇具有较强的抗氧化、抗疲劳、抗毒、抗微波辐射等护体强健功效，而齐墩果酸则可抗炎、抗病毒、抗氧化、抗突变、增强肌体免疫力。女贞子提取物可诱导黑素细胞内肌动蛋白细胞骨架的聚合，促进黑素细胞的黏附及迁移。

临床观察显示，白癜风复色时多是先从白斑毛囊口出现色素沉着，渐向外周扩展，最后融合成片；表明白癜风复色主要是皮损区毛囊黑素细胞的增殖和迁移。近年来，通过对毛囊外毛根鞘无色素黑素细胞的解剖结构、形态学、体外活化黏附和移行方面都进行研究，认为毛囊无色素黑素细胞位于外毛根鞘的中下段，形态类似于周边的毛皮质细胞，外观胞体偏圆，树突不明显，数目较少，常成群集中分布，胞质中充满黑素体，多为Ⅱ、Ⅲ期黑素小体，其形态结构的变化导致功能上的不成熟。毛囊无色素黑素细胞是静止状态的黑素细胞，是表皮黑素细胞的干细胞和储库，能够为特定因素所激活，分化增殖从无活性状态慢慢成熟为有活性状态并沿着外毛根鞘迁移到附近的表皮，形成色素岛，在白癜风复色过程中有着极为重要的作用，而SCF/c-kit信号转导途径对黑素细胞的分化、增殖、迁移均具有关键作用[9]。

在本研究中，我们通过设置不同浓度的女贞子乙醇提取物，研究其对无色素黑素细胞的作用。结果显示，不同浓度的女贞子提取物均可促进无色素黑素细胞的增殖。进一步进行RT-PCR测定c-kit mRNA的相对表达量显示，与对照组相比较， 0.22mg/mL的女贞子提取物的c-kit mRNA的相对表达量具有显著优势，为(0.647±0.046)。

我们前期研究显示[10]，白癜风皮损毛囊AMMC上c-kit表达显著减少，提示白癜风皮损毛囊SCF/c-kit信号通路可能存在异常受损从而致黑素细胞功能失调。而结合本次研究结果，我们认为女贞子乙醇提取物有可能是通过SCF/c-kit信号途径激活毛囊外毛根鞘的无色素黑素细胞，使其分化增殖并迁移至表皮基底层而发挥治疗白癜风的作用。