6周递增负荷运动对大鼠骨骼肌蛋白质组表达的影响

刘延莹 冯庆鲲

摘 要：目的：探討长期大强度运动对大鼠腓肠肌蛋白质组表达的影响，揭示骨骼肌适应性应答的分子机制。方法：SD大鼠随机分为安静对照组与运动训练组。对照组大鼠不给予任何干预，运动训练组进行递增负荷跑台训练（30 min/天， 6天/周）。分别于第2、4和6周末，腹主动脉采血收集血清，测定肌酸激酶（creatine kinase， CK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）活性;第6周末，取大鼠腓肠肌，提取与纯化总蛋白，双向凝胶电泳分离蛋白质，经染色及图像分析，对差异表达显著的蛋白质点进行质谱分析与蛋白质数据库检索。结果：与对照组相比，运动2周组大鼠血清CK浓度显著升高（P<0.05），运动4周组和运动6周组无明显变化（P>0.05）;运动2周组、运动4周组和运动6周组大鼠血清LDH水平均无显著变化（P>0.05）;与对照组相比，6周递增负荷运动组大鼠腓肠肌有36个蛋白质斑点差异表达1.5倍以上，选取9个目标蛋白质点进行质谱鉴定，其中5-羟色胺受体2B （5-hydroxytryptamine receptor 2B， 5-HTR2B）、丙酮酸脱氢酶El元件亚基α （pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha， PDH-E1α）、蛋白酶体亚基-B4 （proteasome subunit beta type-4， PSMB4）、蛋白酶体亚基-B6 （proteasome subunit beta type-6， PSMB6）和蛋白酶体亚基-B7 （proteasome subunit beta type-7， PSMB7）表达显著下调，α-肌动蛋白（α-actin）、M型肌酸激酶（creatine kinase M-type， M-CK）、肌球蛋白轻链2 （myosin regulatory light chain 2， skeletal muscle isform， MLC2）表达显著上调，腺苷酸激酶同工酶1 （adenylate kinase isoenzyme 1， AK1）为新增蛋白质点。结论：6周递增负荷运动后大鼠腓肠肌蛋白质组表达发生显著变化，其中5-HTR2B与神经-肌肉兴奋性有关，PSMB4、PSMB6和PSMB7与骨骼肌蛋白质降解有关，α-actin和MLC2与骨骼肌收缩功能有关，PDH-E1α、M-CK和AK1与骨骼肌能量代谢和利用有关。

关键词：骨骼肌;递增负荷;蛋白质组学;适应性应答

中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006-2076（2019）06-0071-08

Abstract：Objective： To explore the effects of chronic high-intensity exercise on the proteome expression of gastrocnemius muscle in rats and reveal the molecular mechanism of skeletal muscle adaptive

School of P.E. and Health， Zhaoqing University， Zhaoqing 526000， Guangdong， China

response.Methods： Sprague-Dawley rats were randomly divided into sedentary-control group and exercise training group. The rats in the control group were not given any intervention， and the exercise training group was given increasing load treadmill training （30 min/ day， 6 days/week）. At the end of week 2， 4 and 6， serum was collected from the abdominal aorta for the determination of creatine kinase （CK） and lactate dehydrogenase （LDH） activity. Gastrocnemius muscle were taken then total protein was extracted and purified at the end of 6th week. The proteome was analyzed by 2-DE， and the proteins were identified by data retrieved from the protein data bank. Results： Compared with the control group， serum CK concentration was significantly increased in the exercise group for 2 weeks （P<0.05）， while there was no significant change in the exercise group for 4 weeks and the exercise group for 6 weeks （P>0.05）.There was no significant change in serum LDH level in the 2 week group， 4 week group and 6 week group （P>0.05）. There were 36 proteins expressed > 1.5 folds in the gastrocnemius muscle of the rats after the 6-week incremental exercise when compared with the control group. 9 proteins were selected as target protein and analyzed by MS identification. Among them， 5-hydroxytryptamine receptor 2B （5-HTR2B）， pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha （PDH-E1α）， proteasome subunit beta type-4 （PSMB4）， proteasome subunit beta type-6 （PSMB6） and proteasome subunit beta type-7 （PSMB7） were down-regulated， while α-actin， creatine kinase M-type （M-CK）， myosin regulatory light chain 2 （MLC2） were up-regulated， and adenylate kinase isoenzyme 1 （AK1） was the new protein spot. Conclusions：The rats gradually adapted to increasing intensity load during 6 weeks of incremental exercise. The proteasome of the gastrocnemius muscle changed significantly after six incremental exercise. 5-HTR2B is related to the excitability of nerve muscle. PSMB4， PSMB6 and PSMB7 are related to protein degradation of skeletal muscle. α-actin and MLC2 are related to skeletal muscle contraction function， PDH-E1 alpha， M-CK and AK1 are related to skeletal muscle energy metabolism and utilization. The results showed that the adaptive responses of skeletal muscle after long-term high-intensity exercise may be mainly manifested as reduced skeletal muscle fatigue， down-regulated skeletal muscle protein degradation， and enhanced skeletal muscle contraction， fatty acid oxidation， ATP resynthesis and utilization.

Key words：skeletal muscle; incremental load; proteomics; adaptive response

运动剂量与骨骼肌适应之间的关系是体育界研究热点之一[1]。大强度运动训练往往引起体内某些酶活性和蛋白质水平发生改变[2-3]。血清肌酸激酶（creatine kinase， CK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）是用于监控和评定运动训练负荷、机能恢复情况的较敏感指标之一[4-5]。研究发现，一次长时间大强度运动后，血清CK和LDH水平升高，随着运动重复次数的增加，CK和LDH水平升高幅度逐渐减小[6]。Chen等也发现，一组大强度运动后，血清CK活性增加，而在接下来的重复运动后，CK活性没有增加[7]。提示，机体对大强度的运动产生了适应。最新研究进一步揭示，运动员赛前训练期间，骨骼肌对大强度或新训练方法的适应需要一周的“过渡期”[8]。然而，大强度运动诱导的骨骼肌适应性应答的内在分子机制尚不完全明确。

近年来，蛋白组学技术以其高分辨率、高流通量等优点对系统、全面、综合研究机体运动过程中蛋白质组的应答性变化产生深远影响。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis， 2-DE）作为经典的蛋白质组学技术已被作为探究运动引起的蛋白质组变化的标准方法[9]。6周递增负荷运动是常用的大鼠大强度运动训练模型[10-11]。但骨骼肌在此运动过程中的应答变化尚无深入研究。鉴于此，本研究通过蛋白组学技术探究6周递增负荷运动引起骨骼肌差异表达的蛋白质，并揭示这些蛋白的运动应答机制，为科学训练提供理论依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选用SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，购于广州中医药大学实验动物中心，8周龄，平均体重为212±23 g。采用标准啮齿类动物饲料喂食，分笼饲养，自由进食和饮水，人工光照控制昼夜节律，光照时间7：00～19：00，室温20℃～24℃，湿度65%±10%。适应性训练1周后，大鼠随机分为安静对照组（n=24）和运动训练组（n=24），分别于第2、4和6周最后一次训练结束48 h后取材（各8只）。

1.2 运动方案

运动方案参照六周递增负荷训练模型[10-11]。大鼠适应性喂养一周后，进行10 m/min负荷强度的适应性跑台训练，随后分组开始正式实验。正式实验时，对照组大鼠不给予任何干预，运动组大鼠进行为期6周的递增负荷强度跑台运动。具体运动方案为：跑台坡度为0度，第1周跑台速度为15 m/min，此后每周递增5 m/min，至第6周时速度达40 m/min（表1），每次30 min，每天1次，每周6次（周日休息）。

1.3 样品制备

1.3.1 血清制备

分别于第2、4和6周最后一次训练结束48 h后，腹腔注射水合氯醛将大鼠麻醉，腹主动脉采血。常温静置30分钟，以2 500 r/min转速离心20分钟后收集上清，于-80℃冰箱保存待用。

1.3.2 腓肠肌蛋白质提取与纯化

第6周最后一次训练结束48 h后，腹腔注射水合氯醛将大鼠麻醉，取腓肠肌组织，加入液氮研磨直至组织变成粉末。加入裂解液，充分溶解后4℃、12000r/min离心20min，收集上清液，提取蛋白质。对离心后的上清液进行超声处理，破碎核酸，然后再加入丙酮-20℃沉淀过夜，沉淀完的蛋白质经纯化后，-80℃保存备用。

1.4 血清CK和LDH活性测定

血清CK活性测定采用酶联免疫法，LDH活性测定采用微板法。试剂盒购自南京建成生物公司，具体操作按照说明书进行。

1.5 双向凝胶电泳检测与质谱分析

提取与纯化后的蛋白质团块，依次进行一向等点聚焦、二向SDS-PAGE、染色、凝胶的扫描和图像分析，选取蛋白点进行挖点、酶切、肽段抽提和点靶后利用德国布鲁克（Bruker Dalton） UltrafleX III MALDI TOF & TOF/TOF质谱仪进行质谱分析。

1.6 数据分析

数据库检索：利用软件flex Analysis （Bruker Dalton）过滤基线峰、识别信号峰。搜索Uniprot数据库，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能，明确鉴定的蛋白质为何种蛋白质。

血清CK和LDH测定结果以均值±标准差（X±SD）表示，采用SPSS17.0统计软件单因素方差分析法。P<0.05为显著性差异水平，P<0.01为极显著性差异水平。

2 研究结果

2.1 大鼠血清CK和LDH活性的变化

[JP2]表2结果显示，与对照组相比，运动2周组大鼠血清CK活性显著升高（P<0.05），运动4周组和运动6周组无明显变化（P>0.05）;与运动2周组相比，运动4周组和运动6周组大鼠血清CK活性均显著降低（P<0.05）。与对照组相比，运动2周组、運动4周组和运动6周组大鼠血清LDH活性均无显著变化（P>0.05）。

2.2 大鼠腓肠肌蛋白质2-DE图谱分析结果

图1为对照组（C组）和运动6周组（E组）大鼠腓肠肌总蛋白经一向等点聚焦、二向SDS-PAGE、染色、凝胶扫描和图像分析后得到的代表图谱。[FL）]

2.3 大鼠腓肠肌蛋白质组差异表达分析

采用ImageMaster 2D platinum 5.0 （GE）分析软件，对C组和E组的二维凝胶进行差异对比分析;按照1.5倍筛选差异比值，得到全部差异斑点，并截取差异斑点整体截图（图2a）和差异斑点局部截图（图2b&c），并在图中绿色标出。与C组相比，6周递增负荷运动后大鼠腓肠肌有36个蛋白斑点的表达发生1.5倍以上变化（图2a，表3），下调1.5倍以上的蛋白斑点为24个，其中缺失蛋白斑点8个（图2b，表3）;上调15倍以上的蛋白斑点为12个，其中新增蛋白斑点1个（图2c，表3）。

PSMB4、PSMB6和PSMB7与骨骼肌蛋白质降解有关。由26S蛋白酶体和一系列泛素酶等多个催化活性蛋白酶组成的泛素-蛋白酶体通路是细胞内蛋白质选择性降解的重要途徑。26S蛋白酶体是UPP的识别和降解中心，由20S核心蛋白酶和19S调节颗粒构成。PSMB4、PSMB6和 PSMB7属于20S核心蛋白酶β环亚基家族，形成26S蛋白酶体的蛋白水解中心，催化泛素化蛋白的降解。大量研究表明，一次性急性运动或大强度运动引起泛素-蛋白酶体通路激活导致骨骼肌蛋白质降解[25-26]，20S核心蛋白酶在上述过程中起重要作用。因此，PSMB4、PSMB6和 PSMB7的蛋白水平可表征肌肉蛋白质的降解程度。蛋白质组学研究揭示，与一次大强度运动相比，重复大强度运动后即刻，股四头肌26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基6蛋白水平下调4.8倍，泛素羧基末端水解酶14蛋白水平下调3.3倍;48 h时，泛素羧基末端水解酶同工酶L3和泛素羧基末端水解酶14蛋白表达量分别下调1.6倍和4倍;72 h时，泛素羧基末端水解酶14蛋白表达量分别下调3.1倍[24]。提示，重复性大强度运动可抑制泛素-蛋白酶体通路的激活。本研究发现，骨骼肌PSMB4、PSMB6和PSMB7蛋白水平均下降，据此推测，6周递增负荷运动后大鼠骨骼肌蛋白质降解减少。此外，大强度运动通常伴随肌细胞凋亡增加，随着对运动的适应，凋亡的骨骼肌细胞逐渐减少。有研究发现，PSMB4和促凋亡因子Bim可以相互作用并可能存在功能联系[27-28]。值得指出的是，Bim在骨骼肌凋亡过程中起重要作用。由此可见，6周递增负荷运动引起骨骼肌PSMB4蛋白表达减少可能降低肌细胞凋亡。进一步表明，长期大强度递增负荷运动后骨骼肌降解程度降低，对大强度运动产生了适应。

细肌丝的肌动蛋白和粗肌丝的肌球蛋白是两种主要的收缩蛋白，二者的相对滑动是骨骼肌收缩的基础。目前，已发现6 种不同亚型的肌动蛋白。根据等电点的不同，可分为α、β、γ三类。其中，

SymbolaA@

-actin普遍存在于骨骼肌、心肌和血管平滑肌中。不同运动方式对骨骼肌

SymbolaA@

-actin蛋白质及其基因表达的影响不同。连续 2 周75% VO2 max耐力训练（18.5～24 m/min， 跑台， 坡度为0度， 50 min/次， 2次/天）后，股四头肌

SymbolaA@

-actin信使核糖核酸（messenger RNA， mRNA）表达增加22%[29]。于新凯和田野[30]对比研究了大鼠一次下坡跑台训练和一周下坡跑台训练后腓肠肌

SymbolaA@

-actin基因表达的差异。结果显示，连续离心运动可加速一次离心运动后肌肉损伤的恢复，腓肠肌

SymbolaA@

-actin mRNA表达水平显著高于对照组，提示大鼠骨骼肌对连续离心运动逐渐产生适应。有研究发现，骨骼肌

SymbolaA@

-actin mRNA水平在7周递增负荷强度运动后显著升高[31]。一次递增负荷运动至力竭后对大鼠骨骼肌进行蛋白质组学分析发现，骨骼肌SymbolaA@-actin蛋白表达明显下降[23]。蛋白质组学研究揭示，与一次大强度运动相比，重复大强度运动48 h后，股四头肌中泛素-蛋白酶体系统成员—泛素羧基末端水解酶同工酶L3和泛素羧基末端水解酶14蛋白表达量分别下调1.6倍和4倍[24]。本研究显示，6周递增负荷运动后大鼠腓肠肌SymbolaA@-actin蛋白水平升高1.76倍。不难发现，本研究结果与上述文献研究结果一致。据此推测，SymbolaA@-actin蛋白水平升高是骨骼肌对长期大强度运动产生的适应性应答反应。

肌球蛋白是一个六聚体的蛋白质大分子，由多条重链和多条轻链（myosin light chain， MLC）组成，是骨骼肌中含量最多的结构蛋白和收缩蛋白。肌球蛋白受MLC磷酸化调控[32]，磷酸化的肌球蛋白是维持细胞骨架活性和细胞功能的重要效应因子[33]。运动过程中，Ca2+在胞浆聚集，与钙调蛋白结合形成复合物激活肌球蛋白轻链激酶（Myosin light chain kinase， MLCK）进而使MLC磷酸化，激活肌球蛋白头部的ATP酶产生ATP，使肌球蛋白与肌动蛋白相互作用，从而引发骨骼肌收缩。MLC有3种类型：MLC1、MLC2和MLC3。MLC2是肌球蛋白复合体的一个小蛋白，通过调节肌丝Ca2+的敏感性来调节骨骼肌的收缩功能。研究发现，力竭跑台运动引起大鼠比目鱼肌MLC2去磷酸化并降低肌丝MLCK2水平，导致运动能力降低[34]。Hortemo等[35]探究了缩短收缩引起大鼠骨骼肌慢肌纤维疲劳的内在机制，发现在疲劳发生的前20 s内，调节蛋白MLC2快速去磷酸化并伴随力量生成速率下降和收缩能力降低。Stevens等[36]研究揭示，女性受试者经60天卧床休息后，比目鱼肌MLC2磷酸化水平增强，总MLC2糖基化水平下降，而体育运动（有氧+抗阻）能有效阻止卧床后MLC2磷酸化和糖基化水平的改变，改善骨骼肌功能和萎缩程度。本研究发现，6周递增负荷运动后大鼠腓肠肌MLC2蛋白水平升高2.26倍。结合本研究结果SymbolaA@-actin蛋白水平升高，推测大鼠进行6周递增负荷运动后骨骼肌收缩功能增强。

CK是能量快速转换过程中维持ATP/ADP比值恒定的关键酶，与细胞内能量运转、肌肉收缩和ATP再生有直接关系。骨骼肌中CK有两种主要形式：一种存在于细胞质基质（M-CK），另一种与线粒体有关。M-CK在快收缩型骨骼肌高能量转换过程中起重要作用[37]。研究显示，CK完全失活与骨骼肌力量生成和功率输出即刻显著下降有关[38-41]。Ak1属于腺苷酸激酶（adenylate kinase， AK）家族。AK是催化腺苷酸（adenosine monophosphate， AMP）磷酸化生成ADP反应的一种磷酸转移酶，AK及其下游的AMP信号组成了一个完整的能量代谢监测系统，在维持细胞能量平衡中起着重要的作用。研究发现，AK与CK协同作用，共同完成细胞能量监测。基础状态下，CK对生成/消耗的大部分ATP分子的转移起主要作用，然而，当骨骼肌收缩增强或CK活性抑制后，CK向AK系统的磷酸转移催化作用增强。Zhao等[3]通过蛋白质组学研究发现，大强度运动导致运动性疲劳时，骨骼肌M-CK和AK1蛋白水平均显著下降，α-actin蛋白水平也下调。本研究发现，6周递增负荷运动后大鼠腓肠肌M-CK蛋白水平上调1.60倍，AK1为新增蛋白质点。结合本研究α-actin和MLC2蛋白水平显著上调以及Zhao等[3]研究，可以进一步推测，大鼠经6周递增负荷运动后骨骼肌骨骼肌能量代谢升高，有利于增强收缩力量，提高运动能力。

4 结论

4.1 6周递增负荷运动后大鼠腓肠肌蛋白质组发生了显著变化，有36个蛋白质斑点差异表达1.5倍以上。

4.2 選取鉴定出9种目标差异蛋白，其中5-HTR2B与神经-肌肉兴奋性有关，PSMB4、PSMB6和PSMB7与骨骼肌蛋白质降解有关，α-actin和MLC2与骨骼肌收缩功能有关，PDH-E1α、M-CK和AK1与骨骼肌能量代谢和利用有关。

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收稿日期：2019-05-19

基金项目：广东省高等学校青年创新人才项目（2015KQNCX184），肇庆学院博士科研启动项目（612276），肇慶学院自然科学基金项目（201733&201915）。

作者简介：刘延莹（1986- ）， 女，山东潍坊人，博士，讲师，研究方向运动与骨骼肌适应。

作者单位：肇庆学院体育与健康学院，广东 肇庆 526000