陆地棉GhNHX7基因特征及表达的生物信息学分析

周丽容，谭新

（新疆阿拉尔市十六团农业技术推广站，新疆阿拉尔843018）

棉花是世界上主要的天然纤维作物。中国是世界棉花的主产区，新疆是中国最大的棉花种植区[1]。尽管棉花是盐碱地的先锋作物，新疆土壤次生盐碱化仍然严重制约棉花生产，影响中国棉花生产安全。尽管科学家投入了大量的工作研究棉花耐盐机理、选育耐盐棉花品种，但对于棉花盐胁迫的调控机理尚不清晰。前人研究发现，拟南芥中位于质膜上的钠氢交换蛋白NHX7/SOS1（Sodium/hydrogen exchanger 7//salt overly sensitive 1）参与Na＋/H＋转运，维持胞内Na＋和K＋稳态，是响应盐胁迫响应的必需基因[2]。SOS1蛋白通过与一系列蛋白SOS2、SOS3等组成SOS（Salt-overly-sensitive SOS）信号途径来维持离子稳态和调节盐胁迫响应[2-5]。拟南芥AtNHX7/SOS1基因结构复杂，含有23个外显子和22个内含子，编码区序列长度为3 438 bp，编码包含1 146个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白分子量为127 kD，其N端高度疏水，C端高度亲水，包含12个跨膜结构区域[6]。目前，尚未在陆地棉中鉴定并分析GhNHX7基因。棉花基因组序列的测定与发表[7-10]为我们挖掘盐胁迫响应基因、分析相关基因功能提供了资源。我们通过在陆地棉基因组中扫描获得了2个GhNHX7基因。通过基因、蛋白及启动子序列分析，了解该基因的特征。对盐胁迫下GhNHX7基因的表达进行分析，表明该基因参与盐胁迫的响应。本研究为进一步探讨GhNHX7基因在棉花盐胁迫响应中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 GhNHX7基因鉴定及启动子序列获取和基因结构分析

在UNIPROT（https://www.uniprot.org/）数据库中检索并下载拟南芥AtNHX7/SOS1基因。用AtNHX7/SOS1（ID：Q9LKW9）序列作为探针，通过同源性搜索BLASTP软件检索陆地棉基因组（Gossypium hirsutumGenome NAU-NBI Assembly v1.1 &Annotation v1.1，https://www.cottongen.org/node/2068581）蛋白注释文件[11]。在棉花基因组中提取GhNHX7基因起始密码子ATG上游2 000 bp（base pair，碱基对）序列作为该基因的启动子。根据基因序列和CDS序列，利用Gene Structure Display Server（GSDS）2.0[12]（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）软件展示GhNHX7基因结构。利用MCScanX[13]软件分析GhNHX7基因的复制类型。

1.2 GhNHX7蛋白结构域、保守基序分析

用Pfam数据库和NCBI CD search tool检索GhNHX7蛋白保守结构域；用MEME（http://memesuite.org/）数据库检索GhNHX7蛋白中的基序，识别数设置为10。

1.3 GhNHX7基因启动子中顺式作用元件分析

利用植物启动子序列顺式作用元件识别数据库PLACE[14]（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）检 索AtNHX7/SOS1，GhNHX7a和GhNHX7b的启动子序列中的顺式作用元件。

1.4 GhNHX7基因表达分析

GhNHX7基因表达数据来自于NCBI数据库中Gossypium hirsutumTM-1的RNA测序数据数据，登陆号为PRJNA248163（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA248163）。

2 结果与分析

2.1 GhNHX7基因鉴定

通过同源性检索，在陆地棉基因组中鉴定出与拟南芥AtNHX7/SOS1相似性最高的2个基因Gh_A03G0996（相似度63%），Gh_D02G1385（相似度63%），分别命名为GhNHX7a和GhNHX7b（表1）。GhNHX7a和GhNHX7b分别位于A03和D02的染色体的中部区域。通过MCScanX分析发现，GhNHX7a和GhNHX7b基因随着全基因组/片段复制事件的发生而扩增。GhNHX7a和GhNHX7b分别包含22个和21个外显子，与AtNHX7/SOS1外显子数目相近。GhNHX7a和GhNHX7b基因的编码区序列长度分别为3 549 bp和3 555 bp，GC含量均为41%。GhNHX7a和GhNHX7b分别编码包含1 182和1 184个氨基酸残基的蛋白质，分子量分别为131.437 kD和132.242 kD。

表1 GhNHX7基因鉴定及特征

2.2 GhNHX7基因结构特征

利用GSDS 2.0软件可视化AtNHX7、GhNHX7a和GhNHX7b基因结构（图1）。GhNHX7a和GhNHX7b分别包含有22和21外显子，21个和20个内含子。GhNHX7a和GhNHX7b与AtNHX7的外显子特征较为相似，但内含子长度差异较大，可见其基因的长度差异是内含子区序列扩张引起的。

2.3 GhNHX7蛋白结构特征

如图2所示，通过在Pfam数据库中检索发现GhNHX7a/b基因都具有钠氢交换区（Na_H_exchanger）结构域（PF00999）。这个结构域在N端具有10～12个跨膜结构，在C端具有1个大的胞质区（亲水区）。第3～12跨膜区相比其他Na_H_Exchanger家族成员较为一致。其中第6和第7跨膜区高度保守，被认为是转运Na＋和H＋的区域。在NCBI CD-search Tool中检索发现GhNHX7a、GhNHX7b和AtNHX7/SOS1基因除了具有PF00999结构域外，还具有环化核苷酸结合区（Cyclic nucleotide-binding，cNMP-binding）结构域（PF00027）。

图1 AtNHX7、GhNHX7a和GhNHX7b基因结构

图2 AtNHX7、GhNHX7a和GhNHX7b蛋白特征

2.4 GhNHX7基因启动子区顺式作用调控元件分析

利用植物启动子序列顺式作用元件识别数据库PLACE检 索AtNHX7/SOS1，GhNHX7a和GhNHX7b的启动子序列的顺式作用元件。如表2所示，AtNHX7/SOS1，GhNHX7a和GhNHX7b的启动子序列具有较多相同的高度富集顺式作用元件，其中MYC、ARR1-binding element和Dof是重要的胁迫响应元件。推测GhNHX7a和GhNHX7b参与了陆地棉胁迫响应进程。

表2 GhNHX7基因启动子区顺式作用调控元件类型及数目

2.5 GhNHX7a/b基因在盐胁迫后和不同组织的表达分析

为了解GhNHX7a/b在棉花生长发育和响应盐胁迫中的潜在功能，我们研究了GhNHX7a/b盐胁迫的叶片中和在生长发育过程不同棉花组织中的表达量。与0 h相比，盐胁迫后1 h、3 hGhNHXT7a在棉花叶片中表达量无变化；在盐胁迫处理后6 h和12 h表达量提高（图3A），即GhNHX7在处理中期（处理后6～12 h）参与了盐胁迫响应调控。由图3B可以看出，GhNHX7a/b基因在萼片、叶、花、雌蕊、根、雄蕊、茎和花托中的均表达；GhNHX7a基因在茎中的表达量最高，GhNHX7b基因在各个组织中的表达差异不大。

3 讨论与结论

随着我国棉产区西进东移战略的进行，新疆成为我国棉花主产区，但新疆地区土壤盐渍化严重[15]。因此，通过基因工程提高棉花盐胁迫抗性、选育耐盐品种对保障棉花生产安全非常重要。因棉花基因组的复杂性，研究陆地棉盐胁迫响应机理，挖掘耐盐基因较为困难。采用同源性检索等生物信息分析的方法，在棉花基因组中查找其他物种中已经明确的盐胁迫响应基因，是1种较为快速的探索棉花耐盐机理的方法。

图3 GhNHX7a和GhNHX7b基因在盐胁迫下及不同组织中的表达

拟南芥的SOS（salt-overly-sensitive）信号网络，是第一个发现的非生物胁迫响应网络[16]。在前人不断的研究探索下[2-5,17-19]，SOS信号网络被证实并完善。这个信号网络主要包括3个重要的组分：SOS1，SOS2，SOS3。其中SOS1是定位于质膜上的Na＋/H＋逆向转运蛋白，能够调节细胞内的Na＋含量，受到SOS2和SOS3基因的调控。拟南芥的AtNHX7基因在根、茎和叶中均表达，且在根中表达水平比茎中高[20]。在本研究中，通过同源性检索的方法，在陆地棉基因组中检索到了2个GhNHX7基因，分别命名为GhNHX7a和GhNHX7b。这2个基因具有与SOS1基因相似的结构，分别具有22和21个外显子。同时发现GhNHX7a/b蛋白具有与SOS1同样的Na_H_Exchanger和cNMP_binding结构域。保守基序分析发现，SOS1和GhNHX7a/b的保守基序一致。GhNHX7a/b的生物信息分析表明其可能具有与SOS1基因相同的功能。启动子区顺式作用元件分析发现，SOS1和GhNHX7a/b具有大量相同的顺式作用元件，例如MYC、ARR1-binding element和Dof是重要的胁迫响应元件。推测在陆地棉中，GhNHX7a/b基因是胁迫响应基因。基因表达分析发现GhNHX7a/b基因在盐胁迫后表达水平升高，可见其可能参与了棉花盐胁迫响应。该研究为棉花耐盐基因GhNHX7a/b挖掘与利用提供了依据，为深入研究陆地棉耐盐机理，利用基因工程技术进行耐盐棉花的选育提供了资源。