棉花基因组封阻DNA制备方法探讨

刘玉玲，王聪，刘鹏飞，王元昌，刘方，彭仁海*

（1.安阳工学院，河南 安阳455000；2.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳455000）

在植物杂交育种特别是远缘杂交中，可以通过对基因组中染色体或染色体片段来源的识别，分析杂交后代的遗传组成。在起源进化研究中，研究策略之一就是借助基因组间的相似性、染色体间的共线性等对它们的亲缘关系进行推测。荧光原位杂交技术（Flourescencein situhybridization，FISH）能够根据染色体的特异细胞遗传学标记，直观反映基因组间的相似性、染色体间的共线性，在不同物种研究中被广泛应用。其中，以基因组DNA为探针，在靶标基因组染色体上进行原位杂交的基因组原位杂交技术（Genomicin situhybridization，GISH）以及以大片段的BAC（Bacterial artificial chromosome）克隆为探针的BAC-FISH是检测不同来源的染色体组、染色体片段的1种高效方法。在检测外源染色体或染色体片段、研究基因组结构及其空间排布、物种的起源与进化等领域广泛应用[1-3]。

荧光原位杂交技术应用过程中1个重要的阻碍就是基因组重复序列的影响，高含量的重复序列增加了杂交过程中的背景信号。在杂交过程中，封阻DNA基于碱基互补配对原则与基因组重复序列杂交，阻止探针DNA与非特异性位点或非目标DNA杂交，可以降低背景信号，提高荧光原位杂交效率[4-5]。

基因组序列分析表明，棉花基因组重复序列含量高达60%～80%[6-8]，在荧光原位杂交中封阻DNA的应用至关重要。研究表明，经过处理的、长度在200～800 bp基因组DNA片段对非特异性位点的封阻最有效，对基因杂交最有利[9-10]。

目前，封阻DNA制备方法主要有煮沸法、超声波打断法、利用注射针头抽打打断等[4-5]。用超声波打断法影响因素较多，如超声样品的体积、超声探头在样品中深度、超声环境温度、超声波处理时间、超声功率和实验操作等都会对结果产生影响[11]。注射针头抽打打断法操作简单，不依赖其它仪器，但是人为操作注射器力度无法精确控制，所以实验数据的重现性较差。在其它物种中煮沸法和超声波打断法最为常用，但是受基因组DNA含量与碱基组成的影响，不同物种的处理参数会存在差异[5]。本研究以陆地棉为材料，通过不同处理方法、处理条件设置，探讨棉花基因组封阻DNA制备方法。以期为棉花荧光原位杂交的应用提供简单易行的封阻DNA制备手段。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为陆地棉TM-1（四倍体）的嫩叶。FISH验证使用的BAC克隆299N22来源于海岛棉基因组BAC文库。

1.2 方法

1.2.1棉花基因组DNA的提取。选取实验田棉花新长出的叶片约10 g，液氮中研磨30～40 min，磨碎的粉末放入预先冷冻的50 mL离心管中。采用宋国立等[12]改良的CTAB法进行DNA提取。提取的DNA通过1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000进行完整度和浓度检测。

1.2.2煮沸法制备封阻DNA。分别取50μL TM-1基因组DNA置于1.5 mL的离心管中，封口膜密封，固定在浮板上，然后置于沸水中，分别煮沸10 min、15 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min。煮沸后取出置于冰上。待全部结束，2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小。

1.2.3超声波打断法制备封阻DNA。预实验：超声波处理参数较多，首先进行固定超声波参数、调整总超声波处理时间实验。850μL的TM-1基因组DNA置于2 mL离心管，固定在浮板上置于冰水混合物中，注意探头不能碰到管底。参数设置：每个循环中超声处理5 s、间隔时间20 s、功率15%。超声波处理总时间分别为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min。每次从离心管中取出5μL，保存于冰盒中。待全部结束，用2%琼脂糖凝胶电泳对片段大小进行检测。

在预实验的基础上，调整处理参数与处理时间。取200μLTM-1基因组DNA置于500μL EP管。固定在浮板上，置于含有冰水混合物的200 mL烧杯中，放于超声波破碎仪，调整探头在样品中的位置进行处理。超声波处理参数也作了适当调整，即固定总超声波处理时间10 min、处理间隔时间20 s、超声功率25%的基础上，调整单次超声时间，分别设置为每循环中超声时间10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s。每隔5 min拿出样品用涡旋震荡仪震荡3 s，使样品充分混合，完成一次设定的实验参数，即从管中取出5μL，保存于冰盒中。待处理全部结束，用2%琼脂糖凝胶电泳对片段大小进行检测。

1.3 荧光原位杂交

染色体制片、DNA探针制备、FISH参照之前的操作程序进行[13]。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA检测

对CATB法提取的陆地棉TM-1基因组DNA通过Nanodrop 2000进行了浓度与质量检测，2个重复的样品浓度分别为1 540 mg·L－1和2 424 mg·L－1，A260/280值分别为2.00和1.92，符合要求。使用琼脂糖凝胶电泳进行完整度检测（图1）。DNA条带完整，略有拖尾现象，可能是提取过程造成DNA的轻微降解，但综合上述检测结果，可以满足后续实验要求。分别对2个重复的DNA样品进行稀释，浓度800～900 mg·L－1，－20℃存放备用。

2.2 煮沸法制备封阻DNA

通过琼脂糖凝胶检测沸水浴处理10min、15min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min的DNA打断效果，结果表明（图2），沸水浴10 min，DNA样品出现弥散条带，说明DNA已经被打断，沸水浴10 min和15 min的DNA片段长度多数在1 200 bp以上（图2）；DNA样品沸水浴20 min，30 min和40 min，片段大小主要在500 bp以上的较大范围，并且不同处理时间没有明显区别；DNA样品沸水浴50 min和60 min时的DNA片段长度主要集中在400～1 200 bp；DNA样品沸水浴70 min和80 min时，DNA片段主要集中在200～800 bp，其中，80 min处理效果较明显，条带集中，可以满足封阻DNA要求的片段长度；DNA样品沸水浴90 min时的DNA样品条带已经明显下移，片段小于100 bp（图2）。由此可见，棉花基因组DNA沸水浴80 min处理所得DNA片段适宜作封阻DNA。

图1 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测

图2 煮沸处理DNA检测结果

2.3 超声波处理制备封阻DNA

超声波预实验处理结果显示，在超声处理5 s、间隔时间20 s、功率15%的条件下，超声波处理总时间从15 min到240 min，得到的DNA片段与未处理的对照基本上没有差异，说明预实验参数下的超声波处理对棉花DNA打断效果不明显。

调整参数后，超声波处理的基因组DNA通过琼脂糖凝胶检测结果见图3。在固定总超声处理时间10 min、间隔时间20 s、功率25%的条件下，超声时间为10 s时DNA条带已经出现明显的弥散，片段大小主要在1 200 bp以上；超声时间为20 s时，DNA片段大小略有变化；超声时间为30 s时，DNA片段长度集中在500～2 000 bp；超声时间为40 s时，DNA片段主要集中于400～1 200 bp左右；超声时间为60 s时，多数DNA片段小于400 bp。

图3 超声波处理DNA检测结果

2.4 FISH检验封阻DNA效果

299N22是在棉花中发现的1个富含重复序列的BAC克隆，其中的重复序列元件在四倍体棉种的A亚组含量很高[14]。为了检验所制备的封阻DNA在荧光原位杂交中的效果，选用煮沸80 min的陆地棉基因组DNA作封阻，以Dig-Nick Translation Mix标记的BAC-DNA为探针，在陆地棉染色体有丝分裂中期进行荧光原位杂交。杂交混合液分别设置了无封阻DNA和有封阻DNA进行对照。结果显示，无封阻DNA的BAC-FISH中信号弥散分布，主信号不明显（图4a）；沸水浴80 min获得的封阻DNA的BAC-FISH在弥散信号中出现1对明显的主信号（图4b）。

图4 BAC克隆299N22在陆地棉有丝分裂中期染色体荧光原位杂交结果

3 讨论与结论

染色体特异的SSR分子标记NAU1201位于A13和D13染色体[14-16]，BAC克隆299N22是利用标记NAU1201从海岛棉基因组BAC文库筛选出来的[17]，在遗传连锁图中分子标记NAU1201，该BAC克隆片段长度大约为100 kb。由于棉花基因组重复序列含量比较高，使BAC克隆中含有大量目标序列之外的重复元件，导致FISH结果中布满弥散信号，目标信号被掩盖；封使用阻DNA可以结合一部分重复序列，使目标信号得以呈现。因此，沸水浴80 min获得的陆地棉基因组DNA可以作为FISH实验过程中封阻DNA。

煮沸法主要考虑到样品体积和与沸水处理时间，处理过程中影响因素较少，所以相对来说，该方法可重复性较高。实验结果表明：煮沸法制备封阻DNA最适时间为沸水浴80 min。超声波打断法处理的理想参数为超声波处理时间40 s、间隔时间20 s、功率25%，总时间为10 min。但是，超声波打断法涉及到多个仪器参数的设置，主要有超声处理时间、间隔时间、功率、总超声时间等，任何一个参数的改变都会对处理结果产生影响。而且还有操作方面因素的影响，如在处理过程中为了避免温度变化，需要冰浴的使用，冰的融化会影响到探头与样品的接触面，干扰实验结果，所以超声波处理法相比煮沸法而言控制复杂，重复性差，总体处理效果比较，煮沸法要比超声波打断法效果好。