甲基磺酸乙酯诱变棉花突变体剂量分析

臧新山，申贤坤，裴文锋，吴嫚，李兴丽，张金发，于霁雯

（棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所/农业部棉花生物学与遗传育种重点实验室，河南安阳455000）

棉花是重要的经济、油料作物。由于我国不是棉花原产地，因此在棉花育种上所选择的亲本材料大部分都是从国外引种而来[1]。虽然经过科研人员不断的努力，在棉花新品种选育方面取得了一定的成就，但是我国棉花遗传基础狭窄，遗传资源日益枯竭，导致近几年来我国在新育成棉花品种的丰产性以及品质方面很难有大的突破[2]。

利用自然突变和物理化学诱变获得变异材料是作物育种的基础[3]。突变体也是研究植物遗传调控、基因定位、分子克隆、基因表达分析与功能鉴定的良好材料[4]。突变可以分为自然状态下发生的自发突变，以及人工诱导下发生的诱发突变[5]。自发突变是自然状态下发生的突变，是随机的、不定向的，但因自然界中生物的性状普遍是比较稳定的，所以突变频率一般较低，很难进行比较系统的鉴定和收集。诱发突变是人工利用物理和化学因素诱导植物遗传变异，并对其后代突变体进行筛选、鉴定和研究的一种技术，具有提高突变频率、扩大突变谱和促进基因重组的特点，可以在改变单一性状，创造作物新材料方面发挥重要作用[6]。

化学诱变剂大部分是一些分子结构不太稳定的化合物，主要诱导碱基改变，如碱基置换、移码突变等，而染色体水平上的变异则较少。常用的化学诱变剂种类通常有烷化剂、碱基类似物、抗生素、叠氮化物、亚硝酸和羟胺等，棉花诱变育种中经常用到的化学诱变剂主要有甲基磺酸乙酯（Ethyl methyl sulfonate，EMS）、叠氮化钠等[7]。

EMS是1种最为有效且应用较多的化学诱变剂，属于烷化试剂，已被广泛应用在作物育种。EMS诱变的变异体后代基因分离较少、稳定性好，产生的突变类型丰富，被广泛应用于植物突变体库的构建、种质资源创制等研究中[8]。EMS诱变作为1种有效的育种辅助技术，可以改善棉花的重要农艺性状。研究者利用EMS溶液处理棉花种子，获得产量和纤维品质性状都有提高的3个棉花突变品系，认为EMS诱变可以创建有益的突变材料，打破基本产量构成与纤维品质之间负相关的关系[9]。Bechere等[10]用浓度为3.2%（体积分数，下同）的EMS溶液处理棉花种子2 h，获得纤维品质突变体。Patel等[11]利用EMS诱变棉花，获得3 164个M5突变系，筛选到157个纤维品质优良的突变系。Bechere[12]利用浓度为2.45%的EMS溶液处理棉花种子2 h，选育出1个仅有少量短纤维的突变体，具有轧棉速度快且耗能少的优点[12]。研究者利用化学诱变技术来提高油脂含量和改变油脂成分，并获得了棉花油脂突变体[13]。

在前期预实验的基础上，本研究利用1.0%浓度的EMS对棉花种子进行化学诱变处理，以发芽率和生长势为指标，筛选出最佳处理时间，为大规模EMS诱变奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用遗传性稳定的亚洲棉标准系石系亚1号和陆地棉标准系品种TM-1为材料，由国家棉花种质中期库杜雄明研究员提供。石系亚1号为未脱绒的种子；TM-1种子经硫酸脱绒，蒸馏水冲洗干净后，晾干后备用。

EMS诱变剂购自索莱宝公司（北京）。

1.2 EMS诱变处理

种子粒选后，在28℃摇床中以蒸馏水浸种24 h。用吸水纸吸去表面水分，浸入10 mmol·L－1（pH 7.0）的磷酸盐缓冲液稀释的1%EMS诱变液中，未脱绒的石系亚1号材料种子进行4 h、5 h、6 h和7 h的诱变处理，脱绒的TM-1材料种子进行5 h、6 h、7 h和8 h的诱变处理，每个时间点处理100粒种子，未设置重复。诱变剂与种子的比例为：1 mL诱变剂对应1粒种子，对照浸入到10 mmol·L－1（pH 7.0）的磷酸盐缓冲液中，方法和时间同处理。处理后用自来水冲洗5～10次，以去除残留的EMS。

1.3 温室及田间发芽率

将处理过的种子直接播种于营养土中，并种植于中国农业科学院棉花研究所植物培养温室中（28℃，光照12 h/黑暗12 h），统计发芽率和观察生长势。

在筛选到最佳处理时间后，进一步设置3次重复对石系亚1号和TM-1种子分别进行6 h和8 h的EMS诱变，每个重复100粒种子。大规模田间诱变材料种植于中国农业科学院棉花研究所的田间试验农场（河南省安阳县）。

2 结果与分析

2.1 EMS诱变预处理

在28℃摇床中以蒸馏水浸种24 h，用1%浓度EMS处理未脱绒的石系亚1号和脱绒的TM-1种子。然后将种子播种于营养土中，从第2天开始统计出苗率。结果发现，与对照（CK）相比，EMS处理的石系亚1号和TM-1种子发芽时间延迟、发芽率明显降低、出苗不整齐（图1、图2）。对照条件下，石系亚1号和TM-1种子在播种后2 d左右即可见发芽，而经1.0%EMS诱变处理后，播种后2 d未见发芽，3 d后才可见发芽植株，发芽开始时间约晚1 d。从播种后第2天到第10天的调查过程中，除TM-1处理5 h结果外，其他诱变处理后的发芽率都低于对照条件下的发芽率。

图1 EMS处理不同时间下石系亚1号和TM-1种子的发芽率

图2 TM-1种子种植5天后的出苗情况

播种10天后，石系亚1号种子对照组发芽率为89%，1.0%EMS诱变处理4 h、5 h、6 h和7 h的发芽率分别为57%、56.4%、38.1%和28%；；TM-1种子对照组发芽率为69.7%，1.0%EMS诱变处理5 h、6 h、7 h和8 h的发芽率分别为71%、43.3%、55.1%和31.1%。因此，推测在EMS溶液浓度为1.0%条件下，石系亚1号和TM-1材料的最佳诱变时间分别为6 h和8 h（图1）。

2.2 EMS诱变剂量确认

为了进一步确认EMS诱变剂量，在EMS浓度为1.0%条件下，石系亚1号材料种子处理6 h，TM-1材料种子处理8 h为各自的最佳诱变时间。进一步设置3次重复进行EMS诱变。在CK条件下，石系亚1号和TM-1的发芽率分别为87.3%和70.0%；在1.0%EMS诱变处理条件下，石系亚1号和TM-1的发芽率分别为39.3%和32.0%（图3）。该结果进一步确认，1.0%EMS溶液浓度条件下，石系亚1号和TM-1材料的最佳诱变时间分别为6 h和8 h。

图3 石系亚1号和TM-1种子EMS处理后发芽率

2.3 EMS诱变对田间生长情况的影响

EMS诱变处理后，温室田间下，石系亚1号和TM-1的发芽率分别为39.3%和32.0%；而大田中，石系亚1号和TM-1的发芽率分别为21.3%和16.9%。大田中，EMS诱变发芽率较对照明显降低，低于在温室条件下的发芽率（图3、表1）。并且发现，发芽的植株出现一定的畸变株，主要包括不育、早衰和叶片卷曲。

表1 石系亚1号和TM-1发芽率和畸变率统计 %

3 讨论与结论

化学诱变育种在植物品种改良上具有独特的作用：一方面，EMS诱变能够产生具有有利变异的新种质资源，为植物诱变育种提供材料；另一方面，EMS诱变的不确定性为获得重要农艺性状的功能基因提供可能性，对加快植物育种进程和功能基因组学研究都具有重要的意义。

本实验通过对亚洲棉二倍体标准系石系亚1号和陆地棉四倍体标准系TM-1的种子进行1.0%EMS诱变处理，设置不同处理时间梯度，筛选出半致死处理时间（即发芽率为对照的40%～60%、后期生长明显缓慢的处理时间）。结果标明，石系亚1号材料种子在1.0%EMS溶液中处理6 h为最佳诱变时间，TM-1材料种子在EMS溶液浓度为1.0%条件下处理8 h为最佳诱变时间，该研究结果为进一步研究诱变后成活植株的性状奠定基础。

利用EMS诱变产生棉花突变体，之前已有文献报道。例如孔德培等[14]研究表明，利用0.6%EMS溶液（体积分数），28℃处理8 h，种子发芽率为51%，作者认为该处理组合诱变效果最佳；叶春秀等[15]研究表明，1.0%EMS溶液（质量分数）处理新疆早熟陆地棉材料223种子2 h效果最佳；Bechere等[10,12]用浓度为3.2%和2.45%的EMS溶液（体积分数）处理棉花种子2 h，筛选陆地棉突变体。结合这些研究报道，本文作者提出利用1.0 %EMS溶液（体积分数）进行EMS诱变是可行的；经过时间梯度筛选，石系亚1号和TM-1种子的最佳诱变时间分别为6 h和8 h。

大田条件较温室复杂，受种植深度和半干旱等影响，两个材料在大田中的发芽率仅相当于对照的约25%。因此，在大田中进行EMS诱变处理，根据实际情况调节单位面积的播种量。