光遗传学工具蛋白视紫红质通道蛋白-2的结构与特性介绍

程玥 王晞

光遗传学是近年来倍受瞩目的一项生物工程技术,结合了遗传学和光学技术,将对特定波长敏感的外源光敏蛋白(photosensitive protein)表达在细胞膜上,通过单色光照激活光敏蛋白,可控制离子的流动,进而改变细胞膜电位的变化,导致膜的去极化或超极化,使细胞兴奋或抑制,实现对细胞的高时空精准性调控[1]。2010年光遗传学技术被Arrenberg等[2]和Bruegmann等[3]引入到心血管领域,他们发现将视紫红质通道蛋白-2(channelrhodopsin-2,ChR2)表达于心肌细胞膜上,可用470nm左右波长的蓝光改变心肌细胞电活动,而近年研究对象逐渐从细胞水平过度到离体器官水平再到在体水平,光遗传技术对于心脏电活动的影响提示其可能为心电生理、心脏起搏及心律失常研究提供一个新思路[4]。笔者就ChR2这一运用最广泛的兴奋性光敏蛋白进行简要介绍。

1 ChR2的发现

1984年,俄罗斯植物学家在单细胞类微生物趋光运动的研究中发现视紫红质(rhodopsin)是绿藻类单细胞微生物发生趋光运动,将光能转换为动能的关键蛋白,其机制是介导细胞膜内外离子的流动[5]。2003年,Nagel等[6－7]在莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtii)中发现了一种对光敏感的阳离子通道类视紫红质,被命名为紫红质通道蛋白(channelrhodopsin),其两种同源蛋白分别被称为Ch R1和ChR2。后续研究发现ChR1广泛分布在其他趋光藻类、古细菌和真菌中,可介导高选择性的质子流(H＋流),因此Ch R1被广泛应用于测量跨细胞膜的电活动和质子梯度。

ChR2亦广泛分布于趋光藻类,是一种光控的非选择性阳离子通道,对阴离子无渗透性,通过异源细胞表达ChR2,在470 nm左右蓝光光照下,促使ChR2分子构象发生变化,形成阳离子通道,一价和二价阳离子内流,使细胞膜电位变为内正外负,细胞去极化兴奋,改变靶细胞的膜电势产生感应电流,且无需其他蛋白的协同作用,ChR2成为光照可控制膜电位和细胞内离子浓度的有效工具。2005年,ChR2被Karl Deisseroth用于哺乳动物光遗传学研究后,成为研究最常用的兴奋性光敏蛋白[8]。

2 ChR2的结构

ChR2由通道蛋白-2(Chop2)与视黄醛结合形成。Chop2是一种视蛋白,全长含737个氨基酸,包括由一个胞外的氨基末端、七个跨膜域(TMs)和一个胞内的羧基末端构成的[9]。TMs及光电流的功能全部包含在蛋白氨基端315个氨基酸内[10]。视黄醛(也称网膜素,retinal)是由维生素A氧化而成,有多个同分异构体,其中11-顺视黄醛(11-cisretinal)通过其生色团的Schiff碱与Chop2蛋白TM7的赖氨酸结合。光照下11-顺视黄醛吸收光子转变为全-反视黄醛(all-trans-retinal),同时Schiff碱去质子化,释放质子到细胞外侧,全-反视黄醛与Chop2分离,蛋白质异构化,离子通道形成。

Volkov等[11]利用真核蛋白表达系统LEXSY获得了野生型ChR2的晶体结构(图1)。如图所示ChR2在细胞膜内外有三个门,即近细胞膜的中央门(central gate,CG),膜外的细胞外门(extracellular gate,ECG)和膜内的细胞内门(intracellular gate,ICG)。三个门将ChR2自细胞外到细胞内分隔成四个相应的腔:远膜端的细胞外腔1(extracellular1,EC1),近膜端的细胞外腔2(extracellular 2,EC2),近膜端的细胞内腔1(intracellular1,IC1)和远膜端的细胞内腔2(intracellular 2,IC2)。当三个门同时打开时,离子则可迅速通过四个相应的腔,由细胞外进入细胞内。

以TM4中的D156和TM3中的C128命名的DC门,位于Schiff碱附近,在许多Ch R突变体中保守存在,DC门突变可使通道具有长时间的开放状态。

图1 ChR2结构介绍(Volkov O,et al.Science 358.6366(2017):eaan8862.)

3 ChR2的离子通透性及光电流

Nagel等[7]利用非洲爪蟾卵母细胞表达ChR2,采用双电极电压钳技术研究了ChR2对多种离子的通透性,在pH7.6条件下,分别在含LiCl、NaCl、KCl、RbCl、CsCl和NMG-Cl的细胞外液中,将膜电位钳制在－100 m V,记录光照产生的内向光电流大小,证明这几种阳离子(Li＋、Na＋、K＋、Rb＋、Cs＋和NMG＋)均可以经ChR2进入细胞,同时光照产生的电流在含有不同阳离子的溶液中变化很大,产生光电流能力Li＋＞Na＋＞K＋＞Rb＋＞Cs＋＞NMG＋;同样的方法测得ChR2对二价阳离子也有中度渗透性,产生光电流的能力Ca2＋＞Sr2＋＞Ba2＋＞＞Zn2＋、Mg2＋(≈0)。除 了Mg2＋因较强的水合作用致Mg2＋渗透性低外,一价和二价离子产生光电流的大小均与阳离子的原子半径成反比。同时他们用天冬氨酸取代胞外林格液中氯化物,替换后产生的光电流和替换前完全相同,证明阴离子不能通过ChR2。通过ChR2产生的光电流具有内向整流特性,ChR2在持续的光照下会达到较小的稳态电导即脱敏,可通过细胞外的H＋和负膜电位加速脱敏恢复。为证实ChR2的光电流特性与表达载体无关,该研究同时将ChR2表达于哺乳动物细胞系HEK293和BHK细胞上,利用全细胞膜片钳技术亦记录到相似的光电流特性。

4 ChR2的光谱敏感性及光循环

ChR2在400～500 nm波长范围内的蓝光照射下可被激活,通道打开,在470 nm处具有最大活化峰[12]。在470 nm的蓝光照射下,当光子流密度为2.2×1015/(cm2·s－1)的光强时大多数细胞可检测到电流,即激活ChR2所需的470 nm蓝光的功率密度约为(5～12)m W/mm2[13]。

ChR2的光循环在同一条件下按光谱敏感性变化可以分解成四个光中间体(P1、P2、P3、P4),ChR2的整个光周期(ChR2D→ChR2ex→ChR2o→ChR2o→ChR2L→ChR2D)与光中间体的转换(P0480→P1400/520→P2520→P3520→P4480→P0480)一一对应(图2)。光反应导致暗适应的基态(ChR2D)转为激发态(ChR2ex);通道经过200μs打开,呈开放状态(ChR2o)持续1ms;然后10 ms左右时间达到平衡,由ChR2o转为光适应状态(ChR2L),通道关闭;在5 s后,转为暗适应状态(ChR2D),回到初始状态。即在一个光子照射下,晶体结构中蛋白质的结构重排,ChR2光周期从P0480转为P1400中间体,在光激发后不久,随着蓝移(光谱波长变短、频率升高)中间体P1400的减少,红移光谱中间体(P2520)形成,从P1400到P2520充分变化的过渡过程导致通道的打开。此时只要通道保持打开状态,红移状态(光谱波长变长、频率降低)就会持续,P520不会衰减,P2520→P3520。通道关闭与P3520中间体的衰变一起,受到内部p H值的影响,导致P3520→P4480。视黄醛的异构化和shiff碱回到的初始质子化状态决定了基态的恢复,此时需要第二个光子来加速视网膜的变构,并将其转回到可以再次进入线性光循环的基态P0,即光可以显著加速从P4回到P0,使得ChR2的整个光周期在静止的光照条件下成为双光子反应[14]。

图2 ChR2的光循环(Bamann C,et al.Journal of Molecular Biology 375.3(2008):686-694.)

5 ChR2的突变体

野生型ChR2产生光电流需要较高的光强,其脱敏过程使细胞达到小的稳态电导,致产生的光电流较小,同时在连续的光照刺激过程中,野生型ChR2很容易被灭活,所以发现和诱导了一些具有不同功能特性的ChR2突变体,来弥补野生型ChR2的缺陷,常用的ChR2突变体如下所述。

5.1 ChR2(H134R) ChR2(H134R)是第一个被发现的ChR2突变体,在H134位点发生点突变,将第134个氨基酸由组胺酸突变为精胺酸,产生比野生型ChR2大3倍的光电流,通道开关速度比野生型ChR2慢了1倍,这会干扰单个动作电位诱导的精确性,其余性质与野生型ChR2类同。同时在持续光照下,ChR2(H134R)不容易失活,可以用来与其他突变体结合,保持结合体低失活性[15]。

5.2 ChR2(C128X和D156A) C128T/A/S是一组ChR2突变体,其中第128位的半胱氨酸被苏氨酸,丙氨酸或丝氨酸取代,是超灵敏光敏感通道,在非常低的光强下可诱导神经元去极化。C128X与野生型ChR2相比,具有开放通道状态的时间特别长,通道开放时间延长了200～10 000倍,可以打开其离子通道长达30 min。D156A的第156位氨基酸由天冬氨酸转化为丙氨酸,开放状态的时间也延长。C128T、A、S和D156A突变体,四种突变体的光周期均减慢[16]。C128X和D156A双突变体可以消除光循环过程中的失活反应和钝化反应,产生稳态的光电流[17]。用蓝色激光打开通道,然后用绿色或黄色激光关闭通道,但由于它们的通道动力学缓慢且具有强烈的光依赖性失活,C128X和D156A双突变体不适合动作电位诱导的长期控制[18]。

5.3 ChETA ChETA,即E123T,第123氨基酸由谷氨酸变为苏氨酸,这一突变加速了通道动力学,时间精度为纳秒级,半衰期为200 ns,而野生型ChR2的时间精度仅为毫秒级。但是ChETA产生的光电流的大小降低,如果结合H134R突变,E123T产生的光电流可达到野生型ChR2电流的大小,同时保持快速的通道动力学,从而能够刺激高达200 Hz的快速中间神经元,而其他的ChR2通道蛋白只能达到40 Hz[19]。

5.4 ChR2(E123T/T159C) T159C突变体是第159位苏氨酸被半胱氨酸取代,光电流振幅急剧增加,可产生非常大的光电流,其电流大小比野生型ChR2在卵母细胞表达大10倍以上,在神经元表达为2倍。大多数ChR2突变体的通道动力学在去极化的膜电位下显著减慢,但E123T突变体具有加速的光周期,光电流的快速上升和衰减,每个动作电位后均快速复极化,一旦在黑暗中即可迅速恢复到基态,这一特性使通道动力学加速。在非常低的光强度下T159C突变体即可诱导动作电位,其失活类似于野生型ChR2。将T159C与E123T相结合形成E123T/T159C双突变体(ET/TC)时,双突变体可产生大振幅的快速光电流,并且在很宽的频率范围内提高了动作电位诱导的精确度,ET/TC能够对高达60Hz的海马锥体神经元进行可靠和持续的光刺激,但与C128X和D156A的双突变相比,不会导致稳态电流[20]。

5.5 CatCh 钙易位紫红质通道(calcium translocating channelrhodopsin,CatCh)从第115位精氨酸到第139位苏氨酸的每个残基均被半胱氨酸取代,其活化和失活时间略长于野生型ChR2,开放状态的时间增加2倍,其作用谱与野生型ChR2基本相同,最大激发波长为474 nm。当在海马神经元中表达时,CatCh比野生型ChR2的Ca2＋渗透性高6倍,光敏性高70倍,细胞内Ca2＋的升高提高了内表面电位,促电压门控Na＋通道的激活,也间接增加了光敏感性。同时由于光敏感性增加,CatCh不会出现野生型ChR2在高强度蓝光连续光照下潜在细胞损伤的问题,低的光强即可触发精确和快速的动作电位。CatCh可以与其他ChR2突变体组合,能进一步改善光遗传学工具[21]。

6 结语

过去对于荧光蛋白和视蛋白(opsin)的发现,以作为生物示踪和基因标志的工具而广泛应用。但自发现光敏蛋白可以诱发细胞的电活动以来,光遗传学作为新兴学科得到了极大发展,其具有高时空精准性、节律调控性、细胞选择性、非扩步性、非接触性、多向调节性等优点。ChR2作为最常用的兴奋性光敏蛋白,赋予了我们一种新的电生理研究调控方式,通过基因工程的技术可将ChR2表达在哺乳动物细胞上,通过470 nm蓝光控制细胞的电活动,但是ChR2作为离子通道对阳离子无选择性。同时野生型ChR2的通道打开需要高的光强,且连续光刺激易失活,所以实际应用中多以ChR2的突变体为主,根据所需要求,可以选择不同的突变体或双突变体来构建表达载体。在未来可以开发更高电导的突变体,在低表达水平下也能有效地使膜电位去极化,或者开发离子选择性ChR,用来实现钾离子选择性ChR更有效的光诱导的超极化,以及钠选择性ChR更有效的去极化。ChR2在心血管领域研究,将突变体表达于心肌细胞,改变心肌的电活动从而改变心脏的电兴奋与传导,可以通过发现或定向改造新的突变体进一步拓宽光遗传学在心脏疾病机制与治疗中的应用研究。