虾青素对人源增生性瘢痕成纤维细胞的作用及机制研究

葛海辉　陈志鹏　李强

[摘要]目的：探讨虾青素对人源增生性瘢痕成纤维细胞的作用以及机制研究。方法：体外培养人源增生性瘢痕成纤维细胞分别加入0、10、50、100μmol/L浓度的虾青素作用24h，MTT法检测细胞增殖抑制率；流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；ELISA法检测细胞中的TIMP-1、MMP-1、COL-I及COL-III的浓度；Western-blotting检测Bcl-2、α-SMA、TGF-β1及Bax等蛋白的表達。结果： 不同浓度的虾青素使人源增生性瘢痕成纤维细胞活力降低而凋亡率增加；促凋亡蛋白Bax表达上调，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达下调，同时抑制α-SMA、TGF-β1的表达及TIMP-1、MMP-1、COL-I、COL-III合成。结论： 虾青素能诱导人源增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡并抑制HSF细胞增殖、转化，减少胶原分泌，促进胶原酶解，继而有效改善增生性瘢痕的发生与发展。

[关键词]虾青素；人源增生性瘢痕成纤维细胞；细胞增殖；细胞凋亡；胶原合成

[中图分类号]R619+.6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2019）01-0097-03

The Study on Effect and Mechanisms of Astaxanthin in Hypertrophic Scar Fibroblast

GE Hai-hui1，CHEN Zhi-peng1，LI Qiang2，GAO Hai-Wen2

（1.Operating Room，Wuhan Zhonghan Plastic Surgery Hospital，Wuhan 410000，Hubei，China；2.Hubei Institute of Science and Technology Basic Medical College，Wuhan 410050，Hubei，China）

Abstract： Objective To explore the effect of astaxanthin on HSF cells and investigate the mechanisms. Methods The study was divided into two groups， including control group and drug treated group. MTT assay and flow cytometry were used to determine the cell proliferation inhibition ratio and apoptosis rate of HSF cells treated by astaxanthin with different concentrations.The expression of TIMP-1， MMP-1，COL-I，COL-III in the culture cell was detected by ELISA. The proteins of Bcl-2， Bax， were analyzed by Western-blot. Results Astaxanthin can significantly reduce the cell proliferation inhibition ratio and promote cell apoptosis. Astaxanthin inhibited the TIMP-1，MMP-1，COL-I，COL-III synthesis. Western blot showed that the expression of pro-apoptotic factor Bax increased， but the expression of anti-apoptotic factor Bcl-2 and α-SMA，TGF-β1 was suppressed after treatment with astaxanthin. Conclusion Astaxanthin can suppress the HSF proliferation， transformation， and collagen secretion， and accelerate the collagen and induce apoptosis.

Key words： astaxanthin； HSF cells； cell proliferation； apoptosis； collagen secretion

增生性瘢痕常指发生于烧烫伤及手术治疗等各种创伤而引起正常皮肤组织外观形态和组织病理学改变[1]。成纤维细胞通过异常增殖、促纤维化因子异常表达及细胞外基质分泌在增生性瘢痕形成中发挥着关键性的作用[1]。增生性瘢痕虽然对生理健康影响微乎其微，但是对患者容貌以及心理健康有较大的影响。目前针对增生性瘢痕有手术切除、手术植皮、激光、消融技术和瘢痕内注射药物等多种治疗措施[2-3]，但各种治疗措施效果非常有限，如何有效治疗增生性瘢痕成为基础和临床研究人员寻求的突破点。目前国内学者开始探讨中成药对增生性瘢痕的治疗作用。

虾青素是一种次生类胡萝卜素，广泛分布在海洋藻类，菌类以及甲壳类动物中。既往研究证实虾青素具有抗炎、调节氧化应激、调节细胞凋亡等多种生物活性[4-7]。近年来报道虾青素具有抗肝心肾等纤维化的活性[4-7]，而虾青素对人源增生性瘢痕成纤维细胞作用的研究报道较少。因此，本文初步探讨虾青素对细胞系人源增生性瘢痕瘢痕成纤维细胞作用及机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料：中国科学院上海细胞库提供的人源增生性瘢痕成纤维细胞。主要试剂：虾青素购自Sigma有限公司（纯度>99.99%），终浓度小于0.1% DMSO配制成10mmol/L的母液，于-20℃保存；胎牛血清购自Hyclone；培养板购于Costar公司；COL-I及COL-III ELISA试剂盒购自南京建成生物公司；Bax、Bcl-2、α-SMA、TGF-β1及β-actin抗体购自Sigma公司。RPMI1640培养液、辣根酶标记山羊抗兔或山羊抗鼠IgG购自武汉三鹰公司，主要仪器和实验场地由武汉巴菲尔生物技术服务有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：用含10%胎牛血清的Gibco?培养基培养，置于温度为37℃，含有5% CO2的细胞培养箱中，取对数期的细胞进行实验。实验分为4组：对照组（0?mol/L虾青素）、10?mol/L虾青素组、50?mol/L虾青素组和100?mol/L虾青素组。

1.2.2 细胞增殖抑制率测定以及凋亡检测：MTT法检测细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=1-A给药/A对照。 实验组分别加入含不同浓度的白藜芦醇（30、60、120?mol/L）培養液，处理后使用悬液流式细胞仪检测染色后细胞凋亡率。

1.2.3 TIMP-1、MMP-1、COL-I、COL-III浓度及α-SMA、TGF-β1蛋白检测：按照1.2.1分组方法分别处理人源增生性瘢痕成纤维细胞24h后，使用ELASA培养基离心移取上清液。按照TIMP-1、MMP-1、COL-I及COL-III检测试剂盒说明书进行操作。使用Western-blot法检测各组α-SMA、TGF-β1蛋白表达。

1.3 统计学分析：采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析， P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 虾青素对人源增生性瘢痕成纤维细胞增值的影响：经MTT法检测实验发现，不同浓度的虾青素（0、10、50、100?mol/L）抑制HSF细胞增殖。随着虾青素浓度的升高，对人源增生性瘢痕成纤维细胞的增殖抑制作用也增强。

2.2 虾青素对人源增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响：虾青素处理人源增生性瘢痕成纤维细胞24h后，细胞凋亡率逐渐增加。对照组早期凋亡率仅为6.7%，经10、50、100 ?mol/L虾青素作用24h后HSF早期凋亡率为21.9%，32.9%，41.3%，提示虾青素能诱导人源增生性瘢痕成纤维细胞凋亡。见图1。

3 讨论

增生性瘢痕是组织创伤后过度修复的结果，其组织学特征为成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质的异常聚集。在正常伤口愈合过程中，胶原的合成与降解两者之间保持相对平衡。胶原合成明显大于胶原的降解会导致其大量不规则堆积进而形成增生性瘢痕。成纤维细胞的活化、增殖、合成胶原以及分化异常是增生性瘢痕形成的中心环节[1-2]。因此，如何抑制成纤维细胞增殖、转化及细胞外基质产生、集聚以及促进细胞凋亡是改善增生性瘢痕的中心策略。中国传统医学在增生性瘢痕防治中具有历史悠久、疗法独特等优势[8]。中医理论从活血化瘀、清热解毒、软坚散结为主等几个角度对增生性瘢痕进行治疗。而虾青素恰恰是活血化瘀以及清热解毒、软坚散结类中成药的典型代表，在肿瘤以及心血管疾病等诊疗方面有得天独厚的优势[8]。目前国内外学者对虾青素在肿瘤及心血管进行较为深入的研究，但鲜见在瘢痕方面的研究[9-10]，本研究试图研究虾青素对人源增生性瘢痕成纤维细胞增殖，凋亡以及转化的影响。

国外学者从抑制人源增生性瘢痕成纤维细胞增殖以及促进其凋亡角度研究增生性瘢痕进行了大量报道[1-2]。本文研究发现虾青素可有效抑制人源增生性瘢痕成纤维细胞增殖，可通过促凋亡蛋白Bax表达上调以及抑制凋亡蛋白Bcl-2表达下调而诱导细胞凋亡率增加，促进人源增生性瘢痕成纤维细胞凋亡。基质金属蛋白酶（MMPS）和金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）是组织重塑的核心酶，它们功能分别是降解细胞外基质中的多种蛋白以及抑制基质金属蛋白酶活性。本研究检测虾青素对两种代表酶MMP-1以及TIMP-1进行检测发现MMP-1升高而TIMP-1降低，此外研究发现COL-I、COL-III两种胶原经过虾青素处理后显著减少，上述结果提示虾青素可以有效地减少胶原分泌，促进胶原酶解。TGF-β1是增生性瘢痕发生发展过程中的重要调控因子，在人源增生性瘢痕成纤维细胞活化过程中发挥重要调控作用[1]，脂质体沉默TGF-β1表达后可抑制瘢痕成纤维细胞体外增殖以及诱导成纤维细胞的凋亡[11]。平滑肌肌动蛋白（α-SMA） 与增生性瘢痕创面收缩及瘢痕挛缩紧密有关，是纤维细胞向肌成纤维细胞转化的重要标记。在瘢痕与正常皮肤成纤维细胞中导入重组构建逆转录病毒α-SMA过表达的载体后两种细胞的形态、生长、细胞功能均得到明显的抑制[12]，上述结果提示虾青素可抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，改善创面收缩与瘢痕挛缩，从而进一步缓解增生性瘢痕的发生与发展。

综上所述，虾青素能抑制人源增生性瘢痕成纤维细胞增殖并诱导细胞凋亡。同时抑制HSF细胞增殖、转化，减少胶原分泌，促进胶原酶解，继而有效改善增生性瘢痕的发生及发展，本研究为虾青素作为改善增生性瘢痕的潜在中药活性成分奠定中药理论基础，揭开了虾青素在增生性瘢痕防治中鲜为人知的一面，有待后续进一步研究。

[参考文献]

[1]杨欣欣，吴信峰.A型肉毒毒素防治病理性瘢痕的研究进展[J].中国美容医学，2018，27（5）：150-153.

[2]蔡景龙，杨欣.瘢痕美容整形近年来的进展[J].中国美容医学，2016，25（6）：2-3.

[3]杨明，柯友辉，柯晨，等.中医防治增生性瘢痕的基础研究进展[J].中国美容医学，2018，27（1）：152-156.

[4]Zhang J，Wang QZ，Zhao SH，et al.Astaxanthin attenuated pressure overload-induced cardiac dysfunction and myocardial fibrosis：Partially by activating SIRT1[J].Biochim Biophys Acta Gen Subj，2017，1861（7）：1715-1728.

[5]Kim B，Farruggia C，Ku CS，et al.Astaxanthin inhibits inflammation and fibrosis in the liver and adipose tissue of mouse models of diet-induced obesity and nonalcoholic steatohepatitis[J].J Nutr Biochem，2017，43（4）：27-35.

[6]Wang M，Zhang J，Song X，et al.Astaxanthin ameliorates lung fibrosis in vivo and in vitro by preventing transdifferentiation，inhibiting proliferation，and promoting apoptosis of activated cells[J].Food Chem Toxicol，2013，56（3）：450-458.

[7]Xie C，Meng M，Yin X，et al.Effects of astaxanthin on renal fibrosis and cell apoptosis induced by partial unilateral ureteral obstruction in rats[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2013，33（2）：305-308.

[8]王吉成，丁利营.辨证施治防治瘢痕临床体会[J].临床医药文献电子杂志，2016，3（34）：6776.

[9]沈成，王龙，王晞.虾青素在动脉粥样硬化性心血管疾病中的研究进展[J].医学综述，2018，24（3）：417-421.

[10]吕亭亭，葛声.虾青素抗肿瘤作用的研究进展[J].肿瘤代谢与营养电子杂志，2015，6（4）：58-62.

[11]商庆新，袁荣，王炜.反义COL-III抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的研究[J].中华整形外科杂志，2001，17（6）：325-329.

[12]马进，范志宏.α平滑肌肌动蛋白和β肌动蛋白在瘢痕组织中的表达[J].上海第二医科大学学报，2004，24（1）：57.

[收稿日期]2018-09-15 [修回日期]2018-10-12

编辑/贾敏

本文引用格式：葛海辉，陈志鹏，李强，等.虾青素对人源增生性瘢痕成纤维细胞的作用及机制研究[J].中国美容医学，2019，28（1）：97-99.