大鼠慢性进行性肾病的病理学特点

王贝贝，吴文玉，赵蕾，左从林，张惠铭

(北京昭衍新药研究中心，北京 100176)

大鼠慢性进行性肾病(chronic progressive nephropathy，CPN)是实验用大鼠随着年龄的增大而逐渐出现一种进行性肾损害，发病率很高，是老龄大鼠的主要死因之一[1-5]。

CPN在F344系、SD系、Wistar系等品系雄性大鼠中较多见，从5 ～ 6月龄即开始发病，并随着年龄的增大而病情逐渐加重[6]。长期以来，大鼠CPN的发病机制不明，而影响CPN发生的因素诸多，至今没有统一认识。同样，大鼠CPN的病理形态学变化也较为复杂，发病的不同时期具有不同的、进行性加重的各种改变，学界对病变的解释亦存在不同意见[2]。本文观察了大鼠CPN在不同性别、不同种属、不同饲养条件中的发病情况，并对不同时期肾的病理形态改变进行了较为详尽地观察分析和总结，以期对CPN的病理、病因及发病机制提出探索性意见。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD大鼠60只，购自CLEA Japan，Inc.，国产SPF级SD大鼠120只和国产SPF/无病毒抗体VAF(virus antibodies free，VAF)级Wistar大鼠240只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2006-0009】。以上动物均雌雄各半，动物周龄约4～5周，体重约50 ～ 70 g。实验经本机构动物伦理委员会(IACUC)批准(ACU10-214)。

1.1.2 饲养条件

所有动物饲养于本中心SPF级动物房【SYXK(京)2009-0024】，动物房室温21 ～ 26℃，湿度29% ～ 76%，光照12 h明暗交替。动物给予进口和国产两种饲料分别喂养，进口饲料为辐照灭菌实验动物鼠用饲料美福18(MF18)，供应单位为东酵(上海)商贸有限公司；国产饲料为标准SPF级鼠饲料，供应单位为北京科澳协力科技股份有限公司。动物饮用纯化水，用饮水瓶供水，动物自由摄食饮水。

1.1.3 仪器和试剂

全封闭式组织脱水机(Asp300， Leica,美国)、组织包埋机(EG1150H， Leica，美国)、半自动轮转切片机(RM2235， Leica，美国)、摊片烤片一体机(CS-VI， Leica，美国)、全自动染色封片一体机(CV5030， Leica，美国)，恒温烤箱(DRP-9082，中国)，生物显微镜为(CX31，奥林巴斯，日本)，二甲苯、乙醇(北京化工厂，中国)，苏木素、伊红(北京世济合力生物科技有限公司，中国)。

1.2 方法

420只大鼠分为4组，第1组雌雄各30只动物，其余各组雌雄各60只。分别为进口SD大鼠给予进口饲料(组1)，国产SD大鼠喂给予进口饲料(组2)，国产Wistar大鼠给予进口饲料(组3)以及国产Wistar大鼠给予国产饲料(组4)。

动物自由摄食和饮水。试验第104周对存活动物实行安乐死。对所有发现死亡、濒死安乐死及W104安乐死动物进行系统尸检，并对所有动物肾进行病理学检查。

肾经4%中性甲醛固定后，进行取材、脱水、石蜡包埋、切片、HE染色和显微镜观察。使用3级诊断体系对镜下病理改变程度分级，3级病变分别为轻度、中度、重度。对病变肾切片进行PAS和Masson染色以及肾小球内免疫组织化学IgG检测，一抗兔抗大鼠IgG(购自北京博奥森)；二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(购自康为世纪)。

2 结果

2.1 有效动物数

试验过程中有部分死亡动物的组织标本丢失，经核查确认，本实验可参与分析的有效动物总数为411，其中进口饲料喂养组，进口SD大鼠的有效动物数为59，国产SD大鼠的有效动物数为117，国产Wistar大鼠的有效动物数为117，国产饲料喂养的国产Wistar大鼠的有效动物数为118。

2.2 慢性进行性肾病的肉眼观察结果

死亡、濒死安乐死的以及104周观察期结束安乐死的大鼠，部分动物剖检时肉眼可见肾肿大、表面不平、白色调(见图1)；这些异常的肾，显微镜下表现为慢性进行性肾病改变。

注： CPN肾(右侧)标本和正常肾(左侧)标本对比，CPN肾肿大且颜色变白。图1 SD大鼠CPN肾大体改变Note. CPN kidney (right) and normal kidney (left) specimens. The CPN kidneys are pale and enlarged.Figure 1 Macroscopic observation of the CPN kidney in SD rats

2.3 大鼠慢性进行性肾病的组织学形态改变

显微镜下观察所有大鼠的肾，对所观察到的慢性进行性肾病的病变程度分3级描述。

I级(轻度)CPN属早期病变，表现为切片中有病变区域占整个肾组织区域的比例小于或等于30%，病灶主要出现在皮质深层和皮髓质交界处，病灶内受损的肾小管上皮细胞呈嗜碱性染色增强，核增大，空泡状，肾小管基底膜增厚(图2-A～C)。在肾小管病变区中心或附近往往可以看到有病变的肾小球，其病变表现是毛细血管节段性基底膜增厚，系膜细胞及基质增多，部分毛细血管闭塞，免疫组织化学染色肾小球内系膜区为阴性反应(见图2-D～F)。

注：A. 皮质深层肾小管灶状嗜碱性变；B. 嗜碱性变的肾小管上皮细胞核增大，排列紧密，核空泡状，基底膜增厚；C. PAS染色显示肾小管基底膜明显增厚；D. 肾小管病灶内的肾小球呈节段性系膜细胞增生和基质增多，部分毛细血管管腔闭塞；E. 肾小管病灶内之肾小球呈节段性毛细血管基底膜增厚和系膜区增大(PAS)；F. 免疫组织化学显示肾小球内系膜区IgG阴性反应。图2 慢性进行性肾病病变I级(轻度)Note. A. Focal basophilic changes of tubules in the deep layer of renal cortex. B. Enlarged and vacuolated nuclei of densely arrenged epithelial cells, and thickened basement membrane in the basophilic-changed renal tubules. C. Apparent thickening of the bessement membrane. PAS staining, D. A glomerulus near a tubule lesion showing segmental mesangial thickening and increased hyperplasia. PAS staining. E. A glomerulus near a tubule lesion shows segmental thickening of capillary besement membrane and mesangial hyperplasia. PAS staining. F. Negative IgG-staining of the mesangium in a renal glomerulus. Immunohistological staining.Figure 2 Histological changes of grade I (mild) CPN

本期还可以观察到一个极具特征的肾小管病变，即大量肾小管管腔扩张和蛋白管型，主要出现在肾外髓质内带肾小管(图3)。此处恰好是肾小管细段狭窄处，说明慢性肾病的早期就有大量蛋白从肾小球蛋白漏出而潴留在外髓质内带区。

II级(中度)CPN，切片中病灶区域占整个肾组织区域的比例在30% ～ 60%之间，肾小管病灶增大互相连接并扩展至皮质浅层，肾小球和肾小管的病变特点与I级病变的大致相同，但是可见病变区肾小管萎缩，间质纤维增生和炎细胞浸润。此期肾小球病变加重，小球内的病变不再是局灶性，而是全小球性系膜细胞增生或基质增多及硬化，还可见包曼氏囊的上皮细胞增生和囊壁的增厚。另有部分病例的肾小管呈大面积扩张，管型现象更加严重，管型的直径增大，切面看肾小管呈串珠状连接，说明肾小球漏出的蛋白更加严重(见图4)。

III 级(重度)CPN的镜下表现，病灶区域占整个肾组织区域的比例等于或大于60% ～ 90%，病变扩展至全部肾皮质和髓质。病变区的肾小球大部分呈不同程度的纤维化或硬化，极度的纤维化使大量硬化的肾小球“集中”，病变区内的大部分肾小管严重萎缩，肾小管蛋白管型依旧严重，间质纤维组织增生伴有炎细胞浸润。另一部分肾小管高度扩张呈囊状，以及肾小管上皮的肥大再生现象(见图5)。

注：A．正常大鼠肾，可清楚地辨认外髓质外带、外髓质内带和内髓质。在外髓质内带和内髓质的交界处的肾小管急剧变小，官腔狭窄最显著；B. 大鼠慢性进行性肾病I级(早期)，外髓质内带区肾小管出现大量的蛋白管型(粉色)，这是由于肾小球漏出的大量蛋白因外髓质内带和内髓质连接处狭窄的解剖学特点而导致蛋白潴留形成管型。图3 慢性进行性肾病I级蛋白管型分布特点Note. A. Outer and inner zones of the outer medulla, and the inner medulla are distinctly discernible. The tubules are apparently diminished and their lumen is narrow in the border of inner and outer medulla; B. The protein casts are present in the inner zone of outer medulla, as the protein retention in the narrow blocked tubulesat the border of inner zone of outer and inner medullae.Figure 3 Distribution characteristics of protein casts in grade I CPN

注：A．肾小管嗜碱性病灶增大并互相连接，间质发生纤维化伴有炎细胞浸润；B．病灶内和附近的肾小球逐渐发生全小球的系膜增生和纤维化；C．肾小管蛋白管型现象更加严重，管腔变得粗大扭曲，切面呈串珠状连接。图4 慢性进行性肾II级(中度)的病变Note. A. Enlarged and connected basophilic tubular alteration foci, interstitial fibrosis with inflammatory cell infiltration. B. Glomerular mesangial hyperplasia and fibrosis in the foci and vicinity. C. More serious protein casts in the glomerular tubules, with dilated and twisted tubular lumens, showing bead-like connected cross sections.Figure 4 Pathological changes of grade II (moderate) CPN

注：A. 肾病变占据了皮髓质全层，除肾小球和肾小管萎缩纤维化更加严重外，间质重度纤维化，蛋白管型状况依旧；B. Masson 染色显示组织重度纤维化；C. 肾小球纤维化和间质纤维化收缩，出现肾小球“集中”现象；D. Masson染色显示肾小球及间质纤维化。图5 慢性进行性肾病III级(重度)Note. A. Severe atrophy and fibrosis of the whole cortical and medullar layers, and serious interstitial fibrosis and protein casts are present in them; B. Severe fibrosis in the cortex and medulla. Masson staining; C. Glomerular fibrosis and interstitial shrinkage, leading to “concentration” of renal glomeruli. Masson staining. D. Fibrosis of a glomerulus and interstitium. Masson staining.Figure 5 Histological changes of grade III (severe) CPN

2.4 大鼠的慢性进行性肾病在不同性别、品系、饲料之间的发生率比较

在饲养环境相同的情况下，本研究中不同性别、不同品系、不同的饲料喂养的大鼠CPN的发生率有明显差异。雄性大鼠的CPN的发生率明显高于雌性大鼠，雄性大鼠的发生率为48.54%，雌性大鼠的发生率为15.12%，雄性和雌性大鼠的总发病率为31.87%。Wistar大鼠的CPN的发生率为48.51%，SD大鼠的CPN的发生率为9.66%，Wistar大鼠的CPN的发生率明显高于SD大鼠的。进口SD大鼠的CPN的发生率为13.56%，国产SD大鼠的CPN的发生率为6.84%，进口SD大鼠的CPN发病率明显高于国产SD大鼠的。进口饲料喂养的Wistar大鼠的CPN的发生率为42.74%，国产饲料喂养的Wistar大鼠的CPN的发生率为54.24%。国产饲料喂养的大鼠的CPN的发生率略高于进口饲料喂养的大鼠。经核对饲料成分，进口饲料和国产饲料的粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙和磷等成分含量基本相似，主要是蛋白含量差异较大，国产饲料中的粗蛋白成分高于进口饲料的(国产饲料中的蛋白含量为23.5%，进口饲料的蛋白含量为18.1%。SD大鼠均采用进口饲料喂养，未进行CPN发病率比较。

2.5 各种大鼠慢性进行性肾病的病变程度和其对应的发生率

针对所有大鼠将不同病变程度的发生率进行计数。SD和Wistar大鼠CPN的轻度病变例数，占所有发病大鼠45.04%(59/131)，中度和重度病变的CPN的发病例数分别是26.72%(35/131)和28.24%(37/131)，上述结果说明大鼠CPN的病变多为早期病变，只有少数可发展到中期或晚期病变。

3 讨论

许多实验室动物可以有自发性的慢性进行性肾病，但是最引人注意的是大鼠的慢性进行性肾病[1-6]。1990年日本学者岩田和廣内观察了109周老龄F344/DUCrj大鼠的肾病发病情况，CPN的总发病率为45.5%[7]。本实验结果显示SD和Wistar大鼠的CPN总发病率为31.87%。尽管研究资料中应用的大鼠品系不同，我们这个试验结果仍能再次证明大鼠CPN发病率较高的结论。

CPN在雄性动物的发生率很高[7-10]，甚至有文献介绍CPN可发生在所有2岁的雄性试验大鼠[8]。岩田/廣内文献报告雄性大鼠的CPN发病率为63.8%只，雌性大鼠为25.3%[7]，本研究结果显示雄性大鼠CPN发病率为48.54%，雌性大鼠为15.12%，发病率结果与文献的发病率趋势大致相同，因此，雄性大鼠高发CPN的规律也是肯定的。我们还观察到雄性大鼠CPN的病变程度重于雌性大鼠，即重度病变的分布更多。有研究给雌性动物长期喂养雄激素，结果加重了CPN的发病，给雄性大鼠去势能降低CPN发生，而给雌性大鼠去势则对CPN的发生没有影响，因此说明CPN发生确实是雄激素的作用而不是雌激素的缺乏[9]。为什么雄性大鼠有更高的发病率，至今没有定论，也未见有更深入的研究，我们考虑雄激素对CPN肾小球的滤过和肾小管病变的影响重于雌性大鼠，其中也一定有相关的机制，有待于我们做更深入的研究。

关于大鼠品系与CPN的发病的关系，有文献报告说在F344、SD和Wistar大鼠多有较高的发病率[6]，本试验结果显示Wistar大鼠CPN发病率为48.51%，明显高于SD大鼠的9.66%，进口SD大鼠CPN发病率为13.56%，明显高于国产SD大鼠的6.84%，说明不同品系确实CPN的发病率不同。

关于CPN的病因和发病机制，一般认为病因不明。文献报道指出，影响CPN的主要因素包括性别、年龄、基因型、饮食、微生物状态等。饮食中的蛋白质、碳水化合物、摄入量、摄热量、钠和其他成分的含量和质量都能显著的影响CPN的进展[10-13]。这些因素可以影响实验室大鼠CPN的发生和病变程度，特别是高蛋白饮食、高卡路里和高盐饮食，可能使更多的蛋白通过了肾小球而沉积在肾小管内[12-13]。在我们的试验中，国产饲料中蛋白的含量为23.5%，进口饲料的蛋白含量为18.1%，而国产饲料喂养的大鼠的发病率也高于进口饲料喂养的大鼠，即54.24%：42.74%。这个结果也说明实验动物饲料中蛋白含量确实影响CPN的发病。关于本研究中进口和国产饲料其他成分对CPN发病率的比较，由于两种饲料中其他成分含量基本相似，所以考虑对本试验的CPN发病率没有影响。

CPN的发生发展是一个相对长期的过程，因此其病理变化也随之十分复杂，文献中观察记录的大鼠CPN的病变，使用了包括基底膜增厚、系膜区增大、节段性硬化、肾小管的嗜碱性、肾小管扩张、蛋白管型、间质纤维化、间质炎症等词汇，但是强调不能单独使用这些词来诊断CPN[1-2]。本文参考了Hard[14]和Abrass[15]对CPN病变程度的描写，把CPN病变分成三级，即I级(早期/轻度)、II级(中期/中度)和III级(晚期/重度)，这样就能够比较清楚地在实际工作中掌握诊断尺度和判断病情，而且我们的分级情况和Hard和Abrass对病变的描述基本一致。

很长时间以来，对CPN的肾小球和肾小管病变的观察和描述比较明确，但是对肾小球病变是否是促进了肾小管病变的发生，却一直存在争议[6,14-15]。

岩田圣认为，早期肾小球的病变在先，而肾小管与肾间质为适应性或继发性病变[6]。由于小球内检测IgG和IgM均为阴性(Couser and Stillmant)，因而认为大鼠CPN是非免疫学机制引起的[15]。本试验观察到，大鼠CPN早期，病灶中或病灶附近几乎多数情况下能够看到有肾小球呈不同程度肾小球基膜增厚和系膜细胞和基质增生或节段性硬化，这使我们也确信肾小球的病变是CPN发病的始发病变，肾小球的结构或功能改变致使肾小球滤过多量的蛋白，蛋白停留在肾小管中形成管型。由于肾小球有不同程度的节段硬化而致其缺血，经出球动脉流到其所属肾小管区域的血液减少而导致肾小管上皮细胞的先发生变性继而再生的改变，而间质纤维化也是缺血缺氧所致。

关于肾外髓质内带区的大量肾小管扩张，管腔内含有玻璃样蛋白管型，这也是早期CPN的特征性病变，结合大鼠单乳头肾外髓质内带区和内髓质连接部位突然变细的特点，肾小球漏出的蛋白物质极容易停留在外髓质内带区内肾小管。因此，早期肾小管外髓质内带区大量蛋白管型的生成，也解释了早期肾小球病变漏出了大量的蛋白。本实验的大鼠CPN的病变多为早期病变，只有半数可能发展到中期或晚期病变，提醒研究者在大鼠长期毒性实验中可能发生的CPN早期病变须与轻度的肾毒性引起的肾小管改变相辨别。

多年来的荧光染色和电子显微镜观察结果显示，慢性进行性肾病的肾小球未见免疫复合物沉积阳性结果，因此认为大鼠的CPN是一种非炎性、非血管性、非免疫或自家免疫性的独立性疾病[14-15]。大鼠慢性进行性肾病和人类的各种类型肾疾病之间，尚找不到对应的类型[14]，有待病理学家进一步的探讨。

(注：本实验开始于2010年，实验周期为2年，2013年进行病理阅片，2014年试验完成。由于实验涉密问题，于2018年完成撰写。)

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