27种中草药提取物对刺激隐核虫的杀虫活性研究

文/李建民

刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans），隶属于纤毛动物门，隐核虫属，亦称海水刺激隐核虫（Ichthyophthirius）。它几乎可以感染所有的海水鱼类，且感染性强，传播性广，感染率、死亡率都极高，一旦感染几乎无药可治，它给我国乃至世界的海水养殖业造成了巨大的经济损失，也是目前限制海水养殖的一大技术瓶颈，因此其防治技术一直以来是海水养殖鱼类中的研究热点和焦点。

目前对刺激隐核虫具有较好作用的是孔雀石绿和硝酸亚汞，但是因其具有致癌作用已被禁用。之后甲醛、硫酸铜、过氧化氢、过氧乙酸、过碳酸钠、溴硝醇等被用于控制刺激隐核虫病，虽有一定的功效，但长期使用带来的是环境污染、药物残留、耐药性等一系列问题，也成为当前食品安全和水产品出口的绿色贸易壁垒问题，引起社会各界普遍关注。因此，寻找对刺激隐核虫病行之有效、环境友好的药物是一项迫在眉睫的任务。

中草药是天然药物，因其具有无抗药性、无副作用、不引发药源性疾病，同时天然产物具有化学结构多样性，生物活性丰富等优势。利用天然植物开发水产药物，具有低毒、低残留、对非靶标生物毒害较低，对环境无污染等优点，可降低或避免目前化学药物带来的“药物公害”，使用植物源渔药，完全符合渔药的发展方向，同时从天然植物中分离杀虫活性成分，寻找新的杀虫活性物质或药物前体，进而进行仿生合成，不仅是有效创制新药的经济、快捷途径，而且也是对植物资源的合理开发与利用。因此，利用天然植物开发能替代现有药品的无公害、环保型天然植物源杀虫药，对绿色水产品的生产，加快渔药研究的现代化水平有重要意义。本实验对27种中草药的水提物和醇提物筛选对刺激隐核虫具有较好杀灭作用的中草药，为该病的防治提供科学用药的依据，为进一步研制开发高效、低毒、无残留的植物源杀虫剂提供理论依据和技术基础。

一、材料与方法

（一）供试菌株

刺激隐核虫采自福建某大黄鱼繁育基地。

（二）供试中草药样品

27种中草药来自野外采集或药材市场购买，种类分别为独活、黄芩、金银花、枳壳、地锦草、诃子、重楼、黄姜、石榴皮、绵马贯众、白果、吴茱萸、川楝子、大黄、板蓝根、博落回、小果博落回、虎杖、丁香、五倍子、金樱子、马齿苋、百部、蛇床子、白屈菜、冬凌草、槟榔。各味中草药经60℃干燥后粉碎，4℃保存备用。

（三）提取液的制备

本实验采用水提和醇提2种方法对各味中草药进行提取。

水提法：上述供试中草药各取50g倒入烧杯中，加500mL水，密封后放入65℃水浴锅3h，滤出药液，反复提取3次，合并所得滤液，浓缩至浸膏。高压灭菌后置4℃冰箱中保存备用。

醇提法：上述中草药各取50g倒入圆底烧瓶中，加95%的乙醇，加入量以浸过药材表面1cm～2cm为宜，回流提取60min，待冷却后过滤。于药渣中加入乙醇，作第2次回流，约0.5h，冷却后过滤。收集2次的滤液，浓缩至浸膏，高压灭菌后置4℃冰箱中保存待用。

（四）体外杀虫试验

1.虫体的收集

将严重感染刺激隐核虫的大黄鱼放入烧杯中，待刺激隐核虫游出后，用吸管将成熟刺激隐核虫收集放入平皿中，按照本实验室建立的方法进行培养。

2.不同提取物体外杀幼虫试验

试验在24孔细胞培养板上进行，于每个细胞孔中加入约2mL不同浓度的药液和约100个刺激隐核虫幼虫，于用药后15min、1h、2h、3h、4h镜检观察一次，4h后统计各孔的刺激隐核虫死亡率。试验设置DMSO对照组和充分暴气自然水对照组，每组试验重复三次。

刺激隐核虫死亡判断标准：虫体纤毛不运动，胞质不流动，胞膜破裂，细胞核破碎。

（五）数据处理

用SPSS16.0处理药效数据，以平均数±标准误表示，采用方差分析进行差异显著性分析。

二、结果与分析

（一）27种中草药水提物体外杀刺激隐核虫掠食体的结果

由表1可知：27种中药水提物中石榴皮、绵马贯众、白果、博落回、小果博落回、五倍子和白屈菜具有较强的杀虫作用，其中博落回和小果博落回的作用最强，其浓度为60.0mg/L时，可100%杀死刺激隐核虫掠食体，其对掠食体的半数致死浓度分别为12.1mg/L和12.5mg/L。

（二）27种中草药醇提物体杀灭刺激隐核虫掠食体的结果

由表2可知：27种中药醇提物中浓度低于100mg/L就能抑制包囊孵化的天然植物有诃子、重楼、绵马贯众、白果、博落回、小果博落回和白屈菜，其中博落回和小果博落回的作用最强，其浓度为50.0mg/L时，可100%杀灭刺激隐核虫掠食体。

三、讨论

天然植物中的化学成分十分复杂，一种植物体内往往含有多种抗菌活性成分，且它们之间与有机体之间往往呈现十分复杂的相互作用，因此不易产生耐药性。所以植物源成为创制无公害绿色新渔药的重要途径之一，不但直接利用植物资源，而且可进一步分离获得杀虫活性分子、仿生合成渔用原料药。

表1 27种中草药水提物对刺激隐核虫掠食体的杀灭作用

表2 27种中草药醇提物对刺激隐核虫掠食体的杀灭作用

本研究对27种植物中草药体外杀刺激隐核虫的活性进行研究，发现多种植物具有较好的体外杀虫活性。同时结果显示这几味中草药的水提物和醇提物体外杀刺激隐核虫掠食体的效果具有一定的差异性，如石榴皮的水体物对刺激隐核虫掠食体具有较好的杀灭作用，而其醇提物则没有作用或者作用较弱。这主要可能是因为不同溶剂提取物所包含的物质不同，故而所含的活性物质也具有差异性。

博落回和小果博落回是罂粟壳植物，前期研究表明这两种天然药物具有抗菌、消炎、杀虫等生物活性，其主要活性物质可能是血根碱、二氢血根碱和二氢白屈菜红碱。