2种质量浓度DSS致急性溃疡性结肠炎大鼠模型的构建与比较

2019-02-28王倩包永欣

广州中医药大学学报 2019年4期

王倩，包永欣

（1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110847；2.北部战区总医院，辽宁沈阳 110840）

目前，我国罹患溃疡性结肠炎（UC）的人数逐年上涨，但其病因和具体机制尚不明确，选取合适的实验性动物模型成为研究此病的关键。在诸多研究UC的动物模型中，葡聚糖硫酸钠（DSS）以其造模方法简便、症状表现与人体近似等诸多优势脱颖而出。DSS浓度是UC造模成功的关键因素，但DSS的浓度不易掌握，严重影响UC模型的质量。在众多DSS诱导UC大鼠的报道中，DSS的质量浓度以30～50 g/L居多，故在研究急性UC实验性大鼠的造模时，本课题组选取30 g/L的DSS和50 g/L的DSS这2个临界值作为研究和对比的对象，对急性UC的造模浓度进行摸索和研究。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠30只，体质量200～250 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，动物质量合格证号：SCXK（辽）2015-0001。于辽宁中医药大学科研实验中心饲养，实验室通风、采光良好，温度22～23℃，湿度40%～50%。实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2实验试剂DSS，大连美仑生物公司生产（批号：9011-18-1），分子质量36 000～50 000，pH 5.0～7.0，水分＜10%，应用时分别配制成质量浓度为30、50 g/L。

1.3分组与造模将30只大鼠随机分为空白组、DSS低浓度组、DSS高浓度组，每组各10只。DSS低浓度组、DSS高浓度组大鼠分别给予饮用质量浓度为30、50 g/L的DSS，空白组给予大鼠自由饮用蒸馏水，均连续7 d。若大鼠出现稀便、便脓血（肉眼血便或大便隐血阳性）等指征即判断造模成功。

1.4大鼠一般状态观察、疾病活动指数（DAI）评估观察并记录每只大鼠每日的体质量、大便性状和便血情况。参照Cooper等[1]的评分系统进行DAI评分，见表1。DAI=（体质量下降率分数+大便性状分数+便血分数）/3。通过统计及分析DAI评估UC大鼠的一般活动情况。

1.5结肠组织损伤程度的评估大鼠自由饮用DSS 7 d后，禁食不禁水，用100 g/L水合氯醛腹腔麻醉，采用脱颈法致大鼠猝死，剖腹，迅速截取从肛门以上至结肠8～15 cm处结肠组织；用手术剪沿肠系膜纵行线剪开，用冷生理盐水将肠壁冲洗干净，用解剖镜观察结肠形态学观察，并测量结肠长度。取每只大鼠结肠病变最严重处进行病理切块（2 mm×10 mm），常规石蜡包埋，切片，4 μm进行苏木素—伊红（HE）染色，显微镜下观察结肠组织病理改变程度。组织损伤程度可用炎症、病变深度、隐窝破坏与病变范围的评分的乘积表示。结肠黏膜损伤指数（CMDI）的评分标准[2]见表2。

表1 DAI评分标准Table 1 DAI scoring criterion

表2 CMDI的评分标准Table 2 CMDI scoring criterion

1.6统计方法采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠一般状态DSS低浓度组和DSS高浓度组大鼠均出现UC的急性期症状表现：懒动、食量下降、反应迟钝、毛色灰暗不泽、血便、稀便等。DSS低浓度组大鼠UC症状表现较DSS高浓度组轻微。DSS高浓度组大鼠于自由饮用DSS第3天开始出现明显的UC症状，腹泻和粪便隐血试验阳性，第4～7天可见明显的肉眼血便。DSS低浓度组大鼠于自由饮用DSS第5天开始出现明显的UC症状，粪便隐血试验阳性、出现腹泻，第6～7天可见明显肉眼血便。空白组大鼠一般状态正常。

2.2大鼠DAI评分表3结果显示，与空白组比较，DSS低浓度组和DSS高浓度组的DAI评分均上升（P＜0.05），且DSS高浓度组的DAI评分高于DSS低浓度组（P＜0.05）。表明30 g/L DSS和50 g/L DSS均可对UC大鼠产生损伤作用。30 g/L DSS所致大鼠结肠损伤程度较轻微，大便隐血呈阳性反应，肉眼血便较少；而50 g/L DSS所致结肠损伤程度较严重，肉眼血便明显。

表3 各组大鼠DAI评分比较Table 3 Comparison of DAI scores in various groups (±s)

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，与DSS低浓度组比较

DAI评分（s/分）0 1.99±0.994①3.50± 0.527①②组别空白组DSS低浓度组DSS高浓度组N 10 10 10

2.3大鼠结肠一般形态学表现DSS低浓度组、DSS高浓度组大鼠结肠均有充血、水肿、缩短变窄、溃疡、瘀斑等表现。其中：DSS低浓度组大鼠结肠水肿、充血程度较轻，瘀血和溃疡较少，结肠形态改变度小；DSS高浓度组大鼠结肠损伤较为严重，结肠广泛糜烂、溃疡，明显的黏膜水肿，瘀点瘀斑散在结肠黏膜上。空白组大鼠结肠形态无改变。

2.4大鼠结肠长度表4结果显示：与空白组比较，DSS低浓度组和DSS高浓度组的结肠长度均缩短（P＜0.05），且DSS高浓度组结肠长度缩短程度明显（P＜0.05）。表明30 g/L DSS和50 g/L DSS均可对UC大鼠结肠长度产生影响，均可造成结肠长度缩短，而50 g/L DSS所致模型的结肠损伤较30 g/L DSS更为严重。

表4 各组大鼠结肠长度比较Table 4 Comparison of the colon length in various groups (±s)

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，与DSS低浓度组比较

结肠长度（l/cm）3.480±0.3834 2.540±0.1673①1.460± 0.114①②组别空白组DSS低浓度组DSS高浓度组N 10 10 10

2.5大鼠结肠病理学改变大鼠自由饮用DSS 7 d后，DSS低浓度组的结肠炎症程度较轻微，病变深度大多可达肌层，基底隐窝破坏面积较小，病变范围也相应较小，结肠损伤程度较轻微；与DSS低浓度组比较，DSS高浓度组结肠组织炎症呈重度表现，病变深度可达浆膜层，隐窝破坏扩大，上皮组织被破坏；空白组大鼠结肠病理学无明显改变。

2.6大鼠结肠CMDI评分表5结果显示，与空白组比较，DSS低浓度组和DSS高浓度组CMDI评分均上升（P＜0.05），且DSS高浓度组CMDII评分高于DSS低浓度组（P＜0.05）。表明30、50 g/L均可对UC大鼠产生损伤作用，但50 g/L DSS造成的结肠损伤更严重。

表5 各组大鼠CMDI评分比较Table 5 Comparison of CMDI scores in various groups(±s)

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，与DSS低浓度组比较

CMDI评分（s/分）0 6.60±2.547①12.60± 2.319①②组别空白组DSS低浓度组DSS高浓度组N 10 10 10

3 讨论

UC是炎症性肠病的一种，对肠内容物产生异常的免疫应答是其致病机制的特点。异常的免疫应答可致结直肠黏膜出现溃疡和慢性炎症，从而引起腹泻、腹痛、体质量下降、直肠出血、贫血等症状[3-7]。目前，UC的病因和发病机制尚不十分明确，即尚未发现明确的与UC密切相关的特异性因子，故而选择理想的实验动物模型无疑是研究UC的最佳途径之一，而实验模型在一定程度上甚至可以引领某一领域、某一疾病的发展。

在对UC的造模方法中，DSS方法简便、重复性好，具有与人类的UC症状相近似的优势。DSS是由日本学者Ohkusa T[8]于1985年发现的UC造模方法，此后，Okayasu I等[9]于1990年成功建立了DSS诱导的UC小鼠模型。DSS是由蔗糖合成、具有抗凝血和抗止血作用的肝素样硫酸多醣体，其分子式为（C6H7Na3O14S3）n，含硫量一般为16%～20%，极易溶于水（100 g/L），需在室温保存。

DSS可用于UC的急、慢性动物模型的制作研究。短时间予以小鼠高浓度的DSS溶液可建立急性UC模型，长时间给予低浓度DSS可建立慢性UC模型。但不同浓度DSS所造成的实验性UC大鼠的症状表现各异，结肠损伤的严重程度轻重不一，其症状表现和结肠损伤程度缺乏稳定性。鉴于目前缺乏UC稳定的实验性动物模型及成模标准，没有DSS浓度的统一规范。因此，有必要探讨DSS诱导实验性UC大鼠的最佳浓度，进而为UC的研究提供实验基础，亦便于本课题组后续课题的开展。

本研究DAI评分结果显示：30 g/L DSS所致大鼠结肠损伤轻微，大便隐血呈阳性反应，肉眼血便较少，结肠损伤程度较轻微；而DSS高浓度组的结肠损伤更为严重，肉眼血便明显。CMDI评分结果显示：DSS低浓度组的结肠损伤轻微，炎症程度较轻微，病变深度大多可达肌层，基底隐窝破坏面积较小，病变范围也相应较小，结肠损伤程度较轻微；与DSS低浓度组比较，DSS高浓度组的结肠组织呈重度炎症的表现，病变深度随着时间的延长而加深，炎性物质的浸润由黏膜下层逐渐浸润至肌层和浆膜层，隐窝破坏扩大，上皮组织破坏程度逐渐加深。鉴于30 g/L DSS即可成功诱发急性UC，因此，选用质量浓度为30 g/L的DSS造模更合适。