颅痛颗粒对偏头痛模型大鼠行为学及NF-κB信号转导通路的影响

2019-02-28蒲玉婷王小强杨思进白雪

广州中医药大学学报 2019年4期

蒲玉婷，王小强，杨思进，白雪

（西南医科大学附属中医医院心脑病科，四川泸州 646000）

偏头痛是神经系统的常见疾病，其发病特征为反复发作的一侧或两侧搏动性头痛，发作时常伴有恶心、呕吐等自主神经症状特点，约1/3的偏头痛患者在发病前可出现先兆症状[1]。目前偏头痛的治疗仍以缓解症状为主，西药包括非甾体抗炎药、麦角胺制剂、钙通道阻滞剂及5羟色胺（5-HT）受体激动剂等，但这些药物副作用较多，且疗效因人而异，而中医药防治偏头痛具有明显的优势。本课题组继承全国名老中医王明杰的“玄府理论”学术思想及其临床经验，采用风药加虫类药的配伍方法研发出院内制剂——颅痛颗粒（川药制字220080295）。10余年的临床应用表明其对各种类型的头痛均具有较好疗效。但其治疗偏头痛的作用机制尚未阐述清楚。为继承与发展“玄府—微观结构”学术思想，融合中医药创新理论和现代医学基础知识，逐步建立新的中医药理论体系论治疑难疾病，本研究以偏头痛大鼠为研究对象，进一步探讨其对偏头痛的作用机制。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物清洁级健康雄性SD大鼠60只，体质量180～220 g，由西南医科大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK（川）2013-065。

1.2实验药品颅痛颗粒（由羌活、藁本、荆芥、川芎、全蝎、蔓荆子、葛根等组成），由西南医科大学附属中医医院制剂室配制，10 g/袋。琥珀酸舒马普坦片，天津华津制药有限公司生产，批号：6G6924T。硝酸甘油注射液，北京益民药业有限公司生产，批号：20160122。

1.3主要试剂与仪器核因子κB（NF-κB）p65抗体（英国Abcam公司）；磷酸化核因子κB抑制蛋白α（p-IκBα）抗体（美国 Cell Signaling Technology公司）。凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）；mini4垂直电泳槽（北京赛百奥科技有限公司）。

1.4分组与给药将60只大鼠随机分为正常组，模型组，中药高、中、低剂量组，西药组，每组10只。参照动物与人体的体质量剂量折算系数表，中药高、中、低剂量组大鼠分别给予颅痛颗粒（剂量为4.0、2.0、1.0 g·kg-1·d-1）灌胃，西药组大鼠给予琥珀酸舒马普坦片（剂量为6.0 mg·kg-1·d-1）灌胃，连续灌胃7 d。正常组、模型组给予等体积蒸馏水灌胃。

1.5模型制备参考Tassorelli C等[2]的造模方法，模型组，中药低、中、高剂量组及西药组大鼠于末次灌胃1 h后给予颈背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg制备偏头痛模型，正常组大鼠颈背部皮下一次性注射生理盐水10 mg/kg。大鼠造模后2～5 min出现双耳发红、前肢频繁挠头、爬笼、烦躁不安等现象，30～60 min左右达到高峰，持续1～2 h后出现蜷卧、活动减少状态，表明造模成功。

1.6指标观察与检测

1.6.1行为学指标观察观察大鼠在180 min内的行为学变化，大鼠耳红出现及消失时间，前肢挠头以及前肢爬笼次数。

1.6.2 Western blot法检测脑干NF-κBp65、P-IκBα蛋白的表达给予大鼠腹腔麻醉后迅速断头取出新鲜脑组织，参照《大鼠脑立体定位图谱》[3]在冰上分离出脑干，使用预冷的9 g/L氯化钠溶液迅速冲洗干净脑干表面的血迹后放入组织匀浆器中，依照RIPA裂解液和细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书（购买于泸州科阳生物技术有限公司）进行脑干裂解提取蛋白。参照BCA蛋白定量试剂盒（购买于泸州科阳生物技术有限公司）说明书法进行蛋白定量，然后电泳分离蛋白，ECL发光法显色，测定大鼠脑干组织NF-κBp65、p-IκBα蛋白的表达，用凝胶成像系统成像拍照，分析NF-κBp65蛋白、p-IκBα蛋白的表达水平。

1.7统计方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，定量资料用均数±标准差(±s)表示，多组比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），进一步两两比较则用LSD，检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠行为学变化

2.1.1 大鼠各时段挠头次数表1结果显示：模

型组大鼠各时间段挠头次数较正常组明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，中药高、中、低剂量组及西药组大鼠各时间段挠头次数明显减少（P＜0.05），且中药高、中、低剂量组的治疗作用呈剂量依赖性。

2.1.2 大鼠耳红出现时间和消失时间表2结果显示：正常组大鼠无双耳发红症状。模型组及各治疗组大鼠均于造模后2～5 min出现双耳发红现象。与模型组比较，中药高、中、低剂量组及西药组大鼠耳红出现时间明显延后，而持续时间明显缩短（P＜0.05），且中药高、中、低剂量组的治疗作用呈剂量依赖性。

表1 各组大鼠各时段挠头次数比较Table 1 Comparison of the frequency of rat scratching head at various periods in various groups （±s，n/次）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组西药组151～180 min 0.40±0.52 9.10±1.19①1.50±0.85②3.70±0.95②4.70±0.95②2.30±1.64②N 10 10 10 10 10 10 0～30 min 1.10±0.99 24.30±1.34①10.60±1.43②12.00±1.05②16.00±1.16②10.20±1.23②31～60 min 0.80±0.79 43.70±1.34①25.20±1.03②26.90±1.10②34.90±0.99②25.90±0.99②61～90 min 0.60±0.52 37.90±1.37①17.40±0.84②18.50±0.97②25.80±1.14②17.30±0.95②91～120 min 0.70±0.68 30.00±1.16①9.50±0.97②10.40±0.84②11.40±1.08②9.50±1.08②121～150 min 0.70±0.68 18.00±1.16①5.50±1.27②7.60±1.27②9.80±1.32②5.70±1.34②

表2 各组大鼠耳红出现时间和消退时间比较Table 2 Comparison of the time for appearance and disappearance of auricular congestion in various groups （±s，t/min）

①P＜0.05，与模型组比较；②P＜0.05，与西药组比较

组别正常组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组西药组耳红消失时间0 179.00±1.70 117.00±1.25①120.30±1.34①126.50±1.08①118.00±1.16①N 10 10 10 10 10 10耳红出现时间0 1.99±0.46 5.30± 0.95①②3.79± 0.51①②3.01± 0.19①②4.70±1.16①

2.1.3 大鼠各时段爬笼次数造模后，模型组、各治疗组大鼠在4～5 min出现爬笼。模型组在30～60 min爬笼次数达到高峰，此现象可持续1～1.5 h。表3结果显示：与正常组比较，模型组大鼠各时段爬笼次数增加（P＜0.05）；与模型组比较，中药高、中、低剂量组与西药组大鼠爬笼次数减少（P＜0.05），且中药高、中、低剂量组的治疗作用呈剂量依赖性。

2.2大鼠脑干NF-κBp65、p-IκBα表达图1、表4结果显示：与正常组比较，模型组大鼠及各给药组大鼠脑干NF-κBp65、p-IκBα蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，中药高、中、低剂量组及西药组大鼠脑干NF-κBp65、p-IκBα蛋白表达水平降低（P＜0.05），且中药高、中、低剂量组对NF-κBp65、p-IκBα蛋白表达的降低作用呈剂量依赖性。

3 讨论

偏头痛，属于中医“首风”、“脑风”、“头痛”等范畴，多由外邪阻碍清阳、气血凝滞、经络不通等所致。若头痛病程日久、反复发作则会缠绵难愈、瘀血阻滞加重[4]。偏头痛“忽犯忽止，作止无常”的特点与风邪“善行而数变，易夹湿邪，缠绵难愈”等特性密切相关，如《治验回忆录》曰：“头为诸阳之会，贼风久客，瘀塞经隧，与气相搏，遏而为痛。”风邪侵犯头目，上扰清窍，致头部经脉拘急，经脉失养，气机不畅，不通则痛，故可见头痛发作。本课题组继承王明杰教授“从风论治脑病”以及“玄府理论”治疗疑难疾病的学术思想[5]，拟定祛风胜湿、清利头目、通络止痛之治则，并根据多年的临床经验，采用袪风药如羌活、藁本、荆芥、川芎、蔓荆子、葛根等加虫类药全蝎的组方配伍方法，研制的院内制剂颅痛颗粒，能针对偏头痛风湿夹瘀病机，起到开通脑之玄府、清利头部窍道、舒经通络止痛的作用。

表3 各组大鼠各时段爬笼次数比较Table 3 Comparison of the frequency of rat climbing the cage in various groups （±s，n/次）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与西药组比较

组别正常组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组西药组151～180 min 0.70±0.68 6.60±0.97①3.10±0.99②4.50±0.85②5.50± 0.85②③3.60±0.97②N 10 10 10 10 10 10 0～30 min 0.80±0.63 15.10±1.19①10.30±1.16②11.40±0.96②12.90± 1.19②③10.20±1.54②31～60 min 0.70±0.68 22.60±0.84①13.90±0.99②15.70±0.95②18.00± 1.05②③14.40±1.08②61～90 min 0.60±0.69 19.00±1.05①13.60±0.97②14.70±0.95②15.90± 0.99②③13.80±1.03②91～120 min 0.60±0.52 15.60±1.08①10.30±0.95②12.50±0.85②13.80± 0.92②③10.70±1.16②121～150 min 0.70±0.82 12.20±0.92①8.20±0.92②9.50±1.18②10.05± 0.85②③8.50±1.08②

图1 各组大鼠脑干NF-κBp65、p-IκBα蛋白表达比较Figure 1 Comparison of the expression of NF-κBp65 and p-IκBα in the brainstem of various groups（n=5）

表4 各组大鼠脑干NF-κBp65、p-IκBα蛋白表达比较Table 4 Comparison of the protein expression levels of NF-κBp65 and p-IκBα in the brainstem of various groups （±s，p）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与西药组比较

p-IκBα/β-actin 0.517±0.066 1.440±0.015①0.790±0.063②1.121± 0.045②③1.284± 0.055②③0.851±0.074②组别正常组模型组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组西药组N 10 10 10 10 10 10 NF-κBp65/β-actin 0.520±0.103 1.479±0.140①0.766±0.064②1.077± 0.125②③1.326± 0.055②③0.816±0.081②

偏头痛的发病机制目前尚不清楚，其中三叉神经血管学说占主导地位[6]。该学说认为偏头痛发作时大鼠神经血管接头处硬脑膜血管扩张，可刺激神经末梢释放神经肽，进而使血管进一步扩张，从而发生快速的神经炎性反应，主要包括血管通透性增加，血浆蛋白外渗、血管周围区的肥大细胞脱颗粒。NF-κB作为参与炎性反应过程中的关键因子，能够激活早期炎性反应信号通路，诱发神经源性炎症及三叉神经致敏，与偏头痛的发作密切相关[7]。Greco R等[7]研究显示NF-κB可在炎症部位高度表达。静止状态下，NF-κB在细胞质内与IκBα结合形成无活性的复合物。当外界炎症因子刺激细胞并作用于相应受体后，IκBα被IκK磷酸化，p-IκBα从NF-κB处脱落，NF-κB被活化，活化的NF-κB进入细胞核调控下游信号基因cjun、c-fos的转录，进一步激活降钙素基因相关肽（CGRP）、一氧化氮合酶（INOS）[8，9]。这些神经肽可进一步使脑血管扩张、血浆外渗、组织肿胀，发生血管神经性无菌性炎症，出现偏头痛症状。

本研究选用硝酸甘油复制的偏头痛模型，其造模成功的标志主要根据其行为学变化，即造模成功后大鼠出现的双耳发红、前肢频繁挠头、爬笼、烦躁不安等行为学改变[10，11]。本研究结果显示，颅痛颗粒能减少偏头痛大鼠挠头及爬笼次数，缩短耳红时间，改善其行为学症状，且存在量效关系，以高剂量效果最好。偏头痛大鼠脑干NF-κBp65、p-IκBα蛋白表达水平升高，而颅痛颗粒能够降低其表达，且存在一定量效关系。表明颅痛颗粒可改善偏头痛大鼠的行为学变化，其作用机制可能与抑制脑干NF-κB信号通路的激活有关。