黄芪、穿心莲单独或与抗菌肽LL-37联合应用对铜绿假单胞菌生物膜的影响

肖倩， 王展强， 吴行贵， 张伟铮， 石文， 张轩， 罗燕芬， 陈茶

（1.广东省中医院检验医学部，广东广州 510120；2.广州中医药大学第二附属医院，广东广州 510006；3.广州中医药大学基础医学院，广东广州 510006）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）作为一种常见的医院获得性感染的革兰氏阴性条件致病菌，常引起呼吸道、消化道感染，危害人类的健康[1，2]。研究发现PA生物被膜（biofilm）形成时，抗药性增强甚至耐药[3-5]。目前在临床上治疗PA感染仍具有挑战性，一方面是因为多重耐药菌株日益增多，抗生素治疗陷入困境，另一方面是因为抗生素的不合理使用，使PA感染患者病情迁延难治。随着“抗生素后时代”的到来，人们开始更多地求助于非抗生素治疗。黄芪（补益类中药）、穿心莲（清热解毒类中药）是临床方剂配伍中常用的2味中药，均具有抑菌杀菌、增强机体免疫作用[6，7]。有研究发现，抗菌肽LL-37是在人体内唯一发现的内源性抗菌肽，具有广谱的抗微生物活性和中和脂多糖的活性[8-12]。因此，本研究以铜绿假单胞菌为研究对象，以抗菌肽LL-37[13]为阳性对照，观察中药黄芪、穿心莲单独使用或与抗菌肽LL-37联合应用对铜绿假单胞菌生物膜的作用，评价黄芪、穿心莲抗铜绿假单胞菌性能，探讨其与抗菌肽LL-37是否有协同作用，为新药物开发应用提供新策略。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验菌株铜绿假单胞菌野生菌株PAO1为重庆医科大学附属儿童医院邹琳教授惠赠。

1.2主要试剂与仪器黄芪（批号：170800541）、穿心莲（批号：16110864）均购自康美药业股份有限公司；抗菌肽LL-37（批号：JT69395）购自南京杰肽生物科技有限公司。Multiskan FC酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3不同浓度中药的配制分别用去离子水浸泡黄芪、穿心莲1 h（每100 g中药加500 mL去离子水）。用中药煲煎制1 h，冷却后用无菌滤膜过滤，除去细菌。用LB培养基将中药原液稀释2、4、8倍，分别配成高、中、低3种质量浓度（100、50、25g/L），置4℃保存，备用。

1.4野生菌株PAO1生物膜培养取-80℃保存的PAO1于血平板上复苏，37℃培养24 h，进行菌落形态观察、革兰染色、初步生化反应。挑取血平板上各单个菌落，在LB培养基中进行增菌，调至0.5麦氏浓度，备用。取出配好的菌液恢复至室温，用LB培养基稀释菌液100倍，置于37℃恒温摇床中平衡1 h。将长宽约0.5 mm无菌硅胶片置于24孔板中，将平衡后的菌液以1 000 μL/孔加入24孔板中，复孔6个，于CO2培养箱中培养7 d[14]，隔天换液，用于后续实验。

1.5紫外分光光度法鉴定PAO1生物膜参考Jabalameli F等的方法[15]，取出培养PAO17 d的24孔板，弃去LB培养基。用灭菌注射用水清洗硅胶片2次以除去浮游菌，拍干后置于新的24孔板中，同时用无菌硅胶片作为阴性对照。在24孔板中以500 μL/孔加入结晶紫以固定生物膜并染色，3 min后弃去结晶紫，用灭菌注射用水清洗硅胶片3次，置于新的24孔板中，自然风干。向24孔板中以200 μL/孔加入300 g/L醋酸，置于摇床上15 min。混匀后，每孔吸取100 μL溶液于96孔板。应用酶标仪测量吸光度[D（630 nm）]，记录实验结果。

1.6最小抑菌浓度（MIC）测定采用微量肉汤稀释法检测黄芪、穿心莲和抗菌肽LL-37对铜绿假单胞菌PAO1的MIC。取出配好的菌液恢复至室温，每孔加入浓度为2×106CFU/mL的对数生长期菌液100 μL。调整黄芪、穿心莲各质量浓度分为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0 g/L；调整抗菌肽LL-37质量浓度分为1 024、512、256、128、64、32、16、0 μg/mL；无菌生理盐水孔为阴性对照组，加菌液不加药孔为空白对照组。以1∶1的比例加入96孔板中，每个浓度复孔3个，混匀置于CO2培养箱中过夜观察结果，有细菌生长孔混浊，无细菌生长孔清亮且对应的最小用药浓度即为MIC值。

1.7黄芪、穿心莲和抗菌肽LL-37单独或联合用药对PAO1生物膜形成的影响实验分组：黄芪、穿心莲单独用药组（剂量均分别为100、50、25 g/L）；抗菌肽LL-37单独用药组（剂量分别为128、64、32、16 μg/mL）；联合用药组（64、32 μg/mL抗菌肽LL-37+100、50、25 g/L黄芪或穿心莲）。另设无菌生理盐水孔为阴性对照组，未加药PA生物膜孔为空白对照组。将无菌硅胶片置于24孔板中，取出配好的菌液和各组药物以1∶1的比例加入24孔板中，设3个复孔。按“1.4”项制备生物膜。应用酶标仪测定吸光度D（630 nm）值。联合用药时计算抑菌浓度指数（FIC）[16]（FIC=D联合后/D联合前，当FIC≤0.5时，表示二者有协同作用）。

1.8黄芪、穿心莲和抗菌肽LL-37单独或联合用药对成熟生物膜的清除率用“1.4”项的方法培养生物膜若干，第7天时取出生物膜，置于新的24孔板中。PAO1野生菌株分别培养于随机选择的3块硅胶片。采用紫外分光光度法测定各孔D（630 nm），检验生物膜的形成能力，再将各浓度药物以每孔1 000 μL加入24孔板中，设3个复孔，24 h后再检验生物膜的形成能力。按以下公式计算生物膜清除率（p）：p=[药物处理后D（λ）-药物处理前D（λ）]/药物处理前D（λ）×100%。联合用药时计算FIC。

1.9统计方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1紫外分光光度法检测铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成情况图1结果显示：PAO1组D（630 nm）高于阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示野生菌株PAO1形成生物膜。

2.2黄芪、穿心莲、抗菌肽LL-37最低抑菌浓度表1结果显示，各实验浓度中药黄芪、穿心莲对PAO1无抑制作用，抗菌肽LL-37对PA的MIC为256 μg/mL。

2.3单独用药、联合用药对PA生物膜形成的影响

2.3.1 黄芪、穿心莲及抗菌肽LL-37单独用药对PAO1生物膜形成的影响 图2结果显示：与空白对照组比较，不同浓度的黄芪、穿心莲、抗菌肽LL-37单独用药组D（630 nm）值显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），且穿心莲组、抗菌肽LL-37组降低作用更明显；各药物不同浓度组间D（630 nm）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示不同浓度黄芪、穿心莲、抗菌肽LL-37单独用药对野生菌株PAO1生物膜形成均具有抑制作用。

表1 黄芪、穿心莲、抗菌肽LL-37最低抑菌浓度的测定结果Table 1 The minimum inhibitory concentration of Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37

图1 紫外分光光度法测PAO1生物膜形成情况Figure 1 UV spectrophotometric determination results of PAO1 biofilm formation

2.3.2 黄芪与抗菌肽LL-37联合用药对PAO1生物膜形成的影响 图3结果显示，25、50、100 g/L的黄芪分别与32、64 μg/mL的抗菌肽LL-37联合用药不能抑制生物膜的形成。

2.3.3 穿心莲与抗菌肽LL-37联合用药对PAO1生物膜形成的影响 图4结果显示：与空白对照组比较，100 g/L穿心莲+64 μg/mL抗菌肽LL-37、100 g/L穿心莲+32 μg/mL抗菌肽LL-37、50 g/L穿心莲+32 μg/mL 抗菌肽LL-37、25 g/L穿心莲+32 μg/mL抗菌肽LL-37联合用药组D（630 nm）值显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示穿心莲与抗菌肽LL-37联合用药可抑制生物膜的形成，但FIC＞0.5，又提示联合用药并未产生协同作用。

2.4单独用药、联合用药对PAO1成熟生物膜的清除率

2.4.1 黄芪、穿心莲和抗菌肽LL-37单独用药对PAO1成熟生物膜的清除率 表2结果显示：单用黄芪（100、50、25 g/L）对PAO1成熟生物膜的清除率分别为-47.88%、-40.21%、-43.92%，清除近一半成熟生物膜；各浓度黄芪组清除率比较，差异不明显。穿心莲（100、50、25 g/L），抗菌肽LL-37（128、64、32、16 μg/mL）对PAO1成熟生物膜的清除率在29%～60%之间，均大于29%；随着穿心莲浓度的增加，PAO1成熟生物膜清除率逐渐减弱，而随着抗菌肽LL-37浓度的增加，PAO1成熟生物膜清除率逐渐增强。

图2 黄芪、穿心莲及抗菌肽LL-37单独用药对PAO1生物膜形成的影响Figure 2 Effect of Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 alone on PAO1 biofilm formation

图3 黄芪与抗菌肽LL-37联合用药对PAO1生物膜形成的影响Figure 3 Effects of the combination of Radix Astragaliand antibacterial peptide LL-37 on PAO1 biofilm formation

图4 穿心莲与抗菌肽LL-37联合用药对PAO1生物膜形成的影响Figure 4 Effects of the combination of Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 on PAO1 biofilm formation

表2 黄芪、穿心莲及抗菌肽LL-37单独用药对PAO1成熟生物膜的清除率比较Table 2 Comparison of the clearance rate of PAO1 mature biofilm by Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 alone

2.4.2 黄芪/穿心莲与抗菌肽LL-37联合用药对PAO1成熟生物膜的清除率 表3结果显示，25 g/L黄芪+32 μg/mL抗菌肽LL-37组和25 g/L黄芪+16 μg/mL抗菌肽LL-37组对PAO1成熟生物膜的清除率均大于25%，其他联合组对PAO1成熟生物膜的清除作用不理想。FIC＞0.5，提示联合用药抗PAO1成熟生物膜形成亦不产生协同作用。

3 讨论

PA的群体感应系统（quorum sensing system，QS系统）在细菌致病性和耐药性方面发挥重要作用，具有调控细菌粘附、毒力因子分泌、生物膜形成等功能[17，18]。生物膜是由细菌产生的基质封闭并粘附于彼此表面或分界面的细菌群落。生物膜形成后，环境适应能力更强，一方面增加对附着面的粘附性，逃避宿主的免疫作用，另一方面阻止药物进入到细菌内部，使细菌耐药性显著增强。有研究指出，PA的慢性感染主要与生物膜这一生长模式、低毒性和生长速度慢有关，某些情况下生物膜对PA的毒力效应具有更强的协同作用[19，20]。因此，破坏菌膜的多细胞结构是清除菌膜的主要治疗思路，干扰细胞信号系统也是一个很有前景的途径。

表3 黄芪/穿心莲与抗菌肽LL-37联合用药对PAO1成熟生物膜的清除率Table 3 Comparison of the clearance rate of PAO1 biofilms by the combination of Radix Astragali/Herba Andrographis together with antibacterial peptide LL-37

近年来，中药已成为研究抑菌药物的来源之一[21]，其优势在于中药某些成分具有天然抗菌抑菌活性。有文献报道，中药黄芪[22]、穿心莲[23，24]从多个方面对PA的毒力因子、生物膜形成产生广泛抑制作用。因此，在目前PA抗生素耐药正处于严峻的形势下，进一步深入研究PA的致病机制以及寻找针对PA感染的非抗生素治疗具有重要的科学意义和临床价值。

本研究首先成功构建了稳定生物膜模型，应用紫外分光光度法测定生物膜形成能力，结果显示PAO1组D（λ）和阴性对照组D（λ）分别为（0.126 3±0.015 2）和（0.036 0±0.001 5），按照Jabalameli F[15]的判断标准，PAO1能形成生物膜且形成生物膜的能力为中等[2×空白对照组D（λ）＜实验组D（λ）≤4×空白对照组D（λ）]，表明其形成的生物膜比较稳定。

再者，黄芪、穿心莲、抗菌肽LL-37单独用药对PAO1野生菌株生物膜的形成均具有抑制作用。穿心莲和抗菌肽LL-37的抑制作用更明显。各药物不同浓度组间D（630 nm）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但D（630 nm）随着浓度增加呈现减低趋势，表明随着PAO1生物膜的形成减少，药物抑制生物膜形成能力增强，提示黄芪、穿心莲、抗菌肽LL-37单独用药可抑制PAO1生物被膜的起始，在生物膜形成的第一步就发挥了重要的干预作用，呈现浓度依赖效应，与文献[21]报道相符。该文献[21]也报道高浓度黄芪提取液对吸光度造成干扰，同时低浓度（＜50g/L）黄芪对吸光度不造成干扰，显示这种干扰程度在一定范围内较为恒定。本研究选取的黄芪浓度亦在此恒定范围内。

本研究观察联合用药抑制生物膜形成的结果显示：选取25、50、100 g/L的黄芪分别与32、64 μg/mL的抗菌肽LL-37联合用药不能抑制生物膜的形成；100 g/L穿心莲+64 μg/mL抗菌肽LL-37、100 g/L穿心莲+32 μg/mL抗菌肽LL-37、50 g/L穿心莲+32 μg/mL抗菌肽LL-37、25 g/L穿心莲+32 μg/mL抗菌肽LL-37联合用药均能抑制生物膜的形成，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明在生物膜形成早期，联合应用一定浓度的穿心莲+抗菌肽LL-37具有明显的抑制作用；但是联合用药尚未产生协同作用（FIC＞0.5），提示二者配伍使用不能达到较好的抑菌作用。

本研究观察黄芪、穿心莲、抑菌肽LL-37单独用药对已经形成的成熟PAO1生物膜的清除作用，用清除率表示。黄芪（100、50、25 g/L）对PAO1成熟生物膜的清除率分别为-47.88%、-40.21%和-43.92%，清除近一半成熟生物膜。穿心莲（100、50、25 g/L）、抗菌肽LL-37（128、64、32、16 μg/mL）对PAO1成熟生物膜的清除率均在29%～60%之间，均大于29%。黄芪各浓度的清除作用差异不明显。穿心莲随浓度增加，对PAO1成熟生物膜的清除作用反而减弱。抗菌肽LL-37随浓度增加，对PAO1成熟生物膜的清除作用越明显，具有浓度依赖性，显示出抗菌肽LL-37预防和治疗难治性生物膜感染的巨大潜力。

本研究观察联合用药对成熟生物膜抑制作用，研究结果显示，25 g/L黄芪+32 μg/mL抗菌肽LL-37、25 g/L黄芪 +16 μg/mL 抗菌肽LL-37对PAO1成熟生物膜的清除率均大于25%。其他联合组对PAO1成熟生物膜的清除作用不理想，对此现象有待进一步探讨。联合用药抗PAO1成熟生物膜形成也不产生协同作用（FIC＞0.5）

综上所述，黄芪、穿心莲、抗菌肽LL-37单独用药均能够早期抑制PAO1生物膜的形成，呈现浓度依赖性，并且在一定程度上清除成熟的生物膜。黄芪/穿心莲与抗菌肽LL-37联合应用时，不具有协同作用。下一步拟在动物实验中以验证其效。