电针对食源性肥胖大鼠下丘脑自噬相关蛋白7表达的影响

姚俊鹏， 李瑛， 张林

（1.成都中医药大学，四川成都 610075；2.成都中医药大学第三附属医院四川省糖尿病防治中心内科，四川成都 610041）

最新的资料发现中国的肥胖人数位居世界第一[1]，与肥胖相关的心脑血管等疾病的患病率呈明显增加趋势。针刺治疗肥胖切实有效[2]。越来越多的证据发现，下丘脑内自噬与肥胖关系密切[3]。长期高脂饮食诱导的肥胖C57BL/6小鼠与正常饮食小鼠相比，下丘脑弓状核内自噬相关蛋白减少[4]。去血清营养条件下培养下丘脑GT1-7细胞，自噬表达增加[5]。本课题从自噬的角度探讨针刺治疗肥胖的机制。

1 材料与方法

1.1动物雄性SD大鼠40只，SPF级，3～4周龄，体质量70～90 g，成都达硕生物科技有限公司提供，动物许可证号：SCXK（川）2013-24。动物饲养于成都中医药大学实验动物中心，明暗周期各12 h，自由摄食饮水。

1.2试剂及仪器硝酸纤维素膜，美国Hybond公司；自噬相关蛋白7（Autophagy-related protein 7，Atg7）抗体，生物素化山羊抗兔IgG（H+L）抗体，英国abcam（上海）贸易有限公司产品，批号分别为ab133528，ab6721和ab6789；辣根酶标记链霉素卵蛋白素（HRP/A-V），北京中杉金桥生物有限公司，批号：13152A11。DYY-6C电泳仪（美国Bio-RAD公司），UVTransilluminator化学发光凝胶成像仪（美国Bio-RAD公司）。

1.3分组和模型制备大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组对照8只（给予基础饲料）和高脂喂养组32只。高脂饲料配方[6]：脂肪占20%，糖占10%，蛋黄粉占10%，基础饲料占60%，能量为4 928 kcal·kg-1。所有大鼠自由摄食和饮水，饲养温度22～24℃，湿度50%～70%，采用高脂饮食诱导肥胖（diet-induced obesity，DIO）大鼠模型，共饲养14周。肥胖判断标准为超过正常组平均体质量的20%[7]，体质量未达到标准者予以剔除。最后将造模成功的DIO大鼠随机分为肥胖模型组和针刺干预组，每组各8只。

1.4针刺干预选取天枢（ST25）、三阴交（SP6）、中脘（CV12/RN12）和足三里（ST36）进行针刺干预，穴位定位参照李珂等研究[8]，每天1次，每次20 min，每周连续5 d，休息2 d，共干预28 d。电针参数：0.25 mm×13 mm毫针，18 Hz的频率，2 mA的强度。

1.5Western blot检测Atg7蛋白质表达利多卡因腹腔麻醉大鼠后，股动脉放血处死，在冰浴中剥离脑组织后置于液氮罐保存。37℃水浴中解冻后，使用RIPA裂解液提取组织总蛋白，并测定蛋白浓度。根据所测蛋白浓度，每孔按蛋白量100 μg上样。进行SDS-PAGE电泳：接通电源，稳定电压在100 V，15 min，到分离胶以后将电压调至180 V继续电泳，当溴酚兰染料到达凝胶底部时终止电泳。转膜：将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连，接通电源，200 mA转膜1～2 h。封闭：将硝酸纤维素膜放入用TBST Buffer稀释的5%BSA液，用保鲜膜封好，摇床上轻摇2 h，转速50～60。孵育抗体：将硝酸纤维素膜放入一抗（Atg7 1∶200）中，4℃过夜；用TBST将硝酸纤维素膜洗3次，每次5 min；将硝酸纤维素膜放入二抗（稀释浓度1∶5000）中，室温孵育2～3 h；TBST将硝酸纤维素膜洗3次，每次10 min；将硝酸纤维素膜平铺到保鲜膜上，ECL显色，放入化学发光凝胶成像仪的暗室中进行曝光。使用Quantity One软件进行光密度测定，以GADPH为内参计算各组蛋白的相对表达量。

1.6统计方法采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。数据以均数±标准差(±s)表示，多样本均数间比较采用One-Way ANOVA检验，方差齐则采用LSD检验，同组前后比较采用配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1电针干预前后各组大鼠体质量比较高脂喂养14周后，肥胖模型组和针刺干预组大鼠体质量均明显升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），说明造模成功。电针干预4周后，针刺干预组大鼠体质量明显降低，与同期肥胖模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；第18周时，针刺干预组大鼠体质量与电针干预14周时大鼠体质量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2各组大鼠下丘脑Atg7蛋白质表达情况肥胖模型组大鼠下丘脑Atg7蛋白质含量明显低于正常对照组（P＜0.05），电针干预4周后，针刺干预组大鼠下丘脑Atg7蛋白质含量升高，与肥胖模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1和图2。

表1 针刺对大鼠体质量的影响Table 1 Effect of EA on rat body weight （±s，m/g）

表1 针刺对大鼠体质量的影响Table 1 Effect of EA on rat body weight （±s，m/g）

①P＜0.05，与同期正常对照组比较；②P＜0.05，与同期肥胖模型组比较；③P＜0.05，与第14周针刺干预组比较

第18周409.12±25.83 524.32±26.48①470.95± 26.09②③组别正常对照组肥胖模型组针刺干预组n8 8 8第14周410.92±26.47 518.00±24.63①520.37±24.16①

图1 各组大鼠下丘脑Atg7蛋白质表达情况Figure 1 Effect of EA on Atg7 protein expression in hypothalamus of rats in the three groups

图2 各组大鼠下丘脑Atg7蛋白质表达Figure 2 Atg7 protein expression in the hypothalamus of rats in the three groups

3 讨论

针刺可通过中枢和外周机制减轻体质量。研究显示，针刺可通过调控下丘脑AMPK信号通路活性减重[9]；针刺可减少腹型肥胖妇女内脏和肝脏脂肪含量[10]；其外周机制可能与调控脂肪组织的炎症反应[11]、缺氧诱导因子-1α表达、上调UCP1[12]等有关。

本研究结果显示，电针干预肥胖大鼠4周后，大鼠下丘脑Atg7蛋白质含量明显增加。下丘脑自噬基因Atg7的下调可能与肥胖有关。本研究结果表明，高脂饮食可诱导大鼠造成肥胖状态，DIO大鼠下丘脑内自噬指标活性被抑制。自噬是一种高度保守的自我吞噬消化，是降解细胞内受损细胞器的主要机制之一。作为对肥胖的反应，下丘脑对自噬的调控具有细胞特异性。研究[13]表明，基础水平的自噬对维持下丘脑神经元的功能非常重要。在AgRP神经元中特异性抑制自噬，作为对饥饿的反应，生理性增加的神经递质表达被减弱，这上调了POMC和α-MSH的表达，从而导致小鼠的瘦表型。Atg7缺失POMC神经元引起p62在神经元积聚，导致蛋白质聚集，p62蛋白可使自噬体发生泛素化的多功能蛋白质，该蛋白质的增加是细胞内发生自噬缺失的标志。POMC神经元内自噬缺失引起过度进食，能量消耗下降，体质量增加[14]。研究[4]发现，DIO小鼠下丘脑Atg7蛋白表达下降47%，下丘脑特异性Atg7敲除小鼠表现出肥胖状态，提示Atg7在饮食诱导肥胖中发挥着重要作用。参与自噬启动的unc-51样自噬激酶1（unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）和unc-51样自噬激酶2（unc-51 like autophagy activating kinase 2，ULK2）是Atg7的上游信号[15]。Atg7可激活下游的LC3和Atg5/Atg12复合物系统，从而促进自噬体的形成[16]。本研究发现，电针干预可使DIO大鼠体质量显著降低，伴随下丘脑自噬基因Atg7的上调，结果提示电针减轻肥胖大鼠的体质量可能与下丘脑自噬基因Atg7的上调表达有关。

本研究未对Atg7信号通路进行干预，进而观察针刺对肥胖大鼠体质量的影响，未能明确针刺处理与Atg7蛋白质表达改变之间的因果关系。今后的实验中将在该信号通路进行干预的基础上，检测Atg7及其上下游基因的变化，以进一步明确针刺减重的中枢自噬机制。

综上，本研究结果发现高脂饮食可诱导大鼠造成肥胖状态，DIO大鼠下丘脑内自噬水平下调，针刺干预可能通过上调下丘脑自噬基因Atg7的水平降低大鼠体质量。