突变体p53相关的复合物在乳腺癌中的作用

章 杰，段秀庆

(哈尔滨医科大学附属第一医院乳腺外科，哈尔滨 150001)

乳腺癌是全球女性最常见的癌症之一，是女性因癌症死亡的最主要原因。据统计，全球女性乳腺癌新诊病例170万例，占全部女性恶性肿瘤发病的25%，死亡52.19万例，占全部女性恶性肿瘤死亡的15%[1]。在我国，乳腺癌是危害女性生命健康最主要的恶性肿瘤之一，发病率居于女性恶性肿瘤首位，且近年来呈上升趋势[2]。p53基因是乳腺癌最常见的突变靶点，其突变与肿瘤恶性程度以及预后相关[3]。根据癌细胞突变目录，约23%的乳腺癌中存在突变体p53(mutant p53，mutp53)，在基底样乳腺癌中高达80%[4]。p53突变在乳腺癌发展中的重要意义已经在遗传性肿瘤易感疾病Li-Fraumeni综合征中证实[5]。最常见的p53突变是错义突变，导致蛋白中单个氨基酸的取代[3,6]。大多数错义突变发生在p53的DNA结合域内，其削弱了与靶基因启动子序列的相互作用，导致p53转录活性和相关肿瘤抑制功能的丧失。最重要的是，p53结构核心的改变可能会严重影响与其他蛋白质的作用，这可能是mutp53获得致癌活性的关键，这种现象被称为功能获得(gain of function,GOF)[6]。现对mutp53形成的蛋白复合物在乳腺癌中的作用进行综述。

1 Mutp53与致癌性

在乳腺癌中，促进原发肿瘤生长、存活及转移的机制可能与mutp53的GOF关联[6]，部分此类致癌功能归因于mutp53与其他转录因子的相互作用，启动特殊的基因表达程序。此外，部分mutp53的致癌活性依赖于与分子伴侣的相互作用。蛋白质与蛋白质的相互作用可能是mutp53 GOF的关键。

在恶性肿瘤中，除构象改变外，mutp53的积累对其致癌性也是至关重要的，mutp53含量的增加有利于致癌复合物的合成[7]。乳腺癌进展中，mutp53在由无定形聚集体、寡聚体以及淀粉样蛋白原纤维组成的异常蛋白复合物中积累[8]，在这些mutp53相关的聚集体中发现的几种蛋白质参与了细胞代谢、炎症反应、RNA加工、蛋白质和氧化应激调节等致癌过程。一般认为，肿瘤促进因子与mutp53相作用能增强mutp53的致癌活性，而肿瘤抑制因子与mutp53相作用能破坏其抑制肿瘤生长的作用[6]。在乳腺癌模型中也能检测到mutp53蛋白的相互作用[9]。

2 mutp53与转录因子

mutp53可改变癌细胞的基因表达谱[6,9]。虽然mutp53与DNA结合的共有序列尚未确定，但mutp53能与转录因子相作用，增强或抑制这些转录因子的正常活性，从而改变其靶基因表达谱[6]。在人乳腺癌细胞中，mutp53与转录因子E2F1的结合导致ID4转录激活，从而促进乳腺癌组织新血管形成[10]。mutp53与E2F4的结合导致涉及DNA修复的基因下调[11]，从而促进细胞存活、逃避细胞凋亡。对人乳腺癌细胞系的研究表明，低水平的DNA损伤后，mutp53与NFY相作用改变了细胞周期检查点[12]。DNA TopBP1募集mutp53和辅因子p300，介导它们与NFY结合，并刺激癌症的化学抵抗、周期进展以及细胞增殖。Krishnan等[13]的研究表明，致癌共调因子PELP1是在DNA损伤后的NFY靶基因上高效募集mutp53所必需的。在三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)细胞模型中，PELP1的敲除改善了细胞对化疗的反应，抑制了细胞周期进程，激活了细胞凋亡。

在mutp53-NFY的分子通路中，另一种转录因子YAP也发挥着重要作用。YAP是组织生长的主要调节因子，在人肿瘤细胞中形成了YAP-NFY-mutp53复合物,促进与肿瘤细胞存活和增殖相关的基因转录，也可增强癌细胞的侵袭性[14]。这种复合物在乳腺癌中的功能受脂质代谢和机械转导的精细调节。首先，无论是在正常生理状态下还是恶性肿瘤中，YAP的活化均受甲羟戊酸途径调控[15]，而他汀类药物可以抑制甲羟戊酸途径，抵抗YAP/TAZ核活性，钝化mutp53的致癌潜力[14-15]。其次，乳腺癌细胞中mutp53的积累是由甲羟戊酸途径下游的RhoA香叶基香叶基化来维持的，香叶基转移酶1抑制剂能模拟他汀类药物的作用，抵抗mutp53 GOF[16]。mutp53与细胞脂质稳态间依赖胆固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding protein，SREBP)家族的转录因子，调节脂肪酸和胆固醇的生物合成，从而增强甲羟戊酸途径以及增加脂肪酸中间体。mutp53与SREBP2形成复合物，增强SREBP靶基因的表达，通过诱导甲羟戊酸途径影响癌细胞代谢，导致正常乳腺组织结构破坏[17]。此外，mutp53-SREBP复合物间接增强了核定位和处于正反馈环路中YAP/TAZ的活化[15]。因此，通过与YAP、NFY以及SREBP形成复合物，mutp53可以协调脂质代谢、调节致癌转录程序，有利于肿瘤生长和转移。

mutp53还可通过上调蛋白酶影响细胞稳态，对肿瘤抑制机制产生负面影响。该作用至少部分依赖于mutp53与TNBC细胞中特有的转录因子Nrf2的相互作用。由蛋白酶抑制或氧化剂诱导蛋白质应激时，mutp53与Nrf2结合可增强蛋白酶基因的转录[18]，这减轻了蛋白质负荷，并有利于控制增殖和凋亡相关蛋白酶的降解，从而导致致癌基因表达。Lisek等[19]研究发现，mutp53-Nrf2不仅促进了蛋白酶亚基的表达，而且还协调特定亚群Nrf2依赖性抗氧化反应基因的转录，促进乳腺癌细胞的存活。mutp53还可通过激活野生型p53蛋白的转录抑制因子，增强癌细胞对蛋白毒性的耐受性。野生型p53能负调节热激转录因子1的细胞保护功能，诱导DNA损伤后细胞的衰老。在TNBC细胞中，mutp53通过与热激转录因子1相互作用，促进热激蛋白(heat shock protein，HSP)的转录，并广泛增强热激转录因子1致癌信号，从而为肿瘤细胞提供生长优势[20]。

3 mutp53与肿瘤抑制性

mutp53与转录因子的相互作用也可以是抑制性的，mutp53可抑制p53家族的其他成员——p63和p73。研究表明，p53核心结构域构象的变化可影响p53与p63/p73间的作用[21]。mutp53作用于p63，损害TAp63转录活性，阻碍其抑制转移的功能[22]。在其他合作分子以及内在和外在信号的参与下，mutp53可抵抗p63的肿瘤抑制性[23]。在人和鼠细胞模型中，转化生长因子-β与Ras协同作用以诱导mutp53-TAp63复合物的组装，其中Smad2作为必需平台，促进mutp53和TAp63的相互作用[23]。mutp53-TAp63复合物抑制两种p63相关的转移抑制因子即Sharp1和细胞周期蛋白G2的表达，增强肿瘤细胞的侵袭性[23]。同样，Pin1的异构化有利于mutp53与TNBC细胞中TAp63的相互作用[24]。mutp53不仅能抑制p63转录活性，还能增强α5β1整合素和表皮生长因子受体的再循环，激活了Rho和蛋白激酶B，最后促进癌细胞迁移和侵袭[20]。整合素/受体再循环介导的磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信号转导通路的增强也促进WIP基因(wound-induced protein)的激活，通过增强YAP/TAZ的稳定性刺激致癌[25]。

mutp53还与多种p73亚型相互作用，影响mutp53的转录活性，并抵抗细胞凋亡[26]。各种错义mutp53(R175H，Y220C和R248W)与人类癌细胞中的p63和p73结合，破坏了靶基因的反式激活[27]。在转基因小鼠中，mutp53(R172H)在乳腺中的稳定表达降低了DNA损伤诱导的细胞凋亡， 通过药物抑制mutp53及再激活p73可恢复正常细胞凋亡[28]。研究表明，mutp53通过阻止p73对转录因子NFY的抑制作用增强肿瘤转移，提高侵袭性血小板衍生生长因子受体β因子的表达[29]。

4 Mutp53与染色质

Mutp53可通过与非序列特异性转录因子的核蛋白相作用干扰细胞凋亡并促进乳腺癌细胞存活。mutp53与核酸酶Mre11的相作用，通过在小鼠的人化p53等位基因中引入突变，导致mutp53蛋白高表达，破坏DNA双链断裂过程中Mre11-Rad50-NBS1(nijmegen breakage syndrome 1)复合物的形成，从而导致肿瘤细胞增殖过程中共济失调毛细血管扩张突变功能受损和mutp53的累积。因此，在携带mutp53的乳腺癌患者中可观察到染色体异常的细胞数量明显增加[30]。

在人乳腺癌细胞系中，另一种mutp53 GOF涉及mutp53与SWI-SNF(switch/sucrose non-fermentable)染色质的相互作用。通过这种作用，mutp53可能会影响乳腺癌中染色质的状态和基因转录。SWI-SNF复合物将全基因组与转录调控元件联系起来，调节核小体占位。SWI-SNF-mutp53三元复合物增强了血管内皮生长因子受体2信号，而且SWI/SNF的功能影响多个mutp53靶基因，这表明该复合物广泛作用于mutp53依赖性的基因调控[31]。

5 Mutp53与细胞质

细胞质可减弱或扩增不同的细胞信号通路，并且是信号通路相互联系的地方。mutp53的部分GOF活性是通过mutp53与细胞质中信号转导相关的介质结合而获得的。mutp53可与人乳腺癌细胞细胞质中的肿瘤抑制因子DAB2IP(DAB2 interacting protein)结合。DAB2IP是细胞质中Ras GTP酶激活蛋白，也可作为信号支架调控细胞对多种信号的反应[32]。DAB2IP与mutp53蛋白直接结合干扰了DAB2IP的生理作用，改变了细胞对胞吞的反应。 mutp53-DAB2IP复合物促进炎症刺激，减少肿瘤坏死因子诱导的促凋亡的细胞凋亡信号调节激酶1-c-Jun氨基端激酶轴的激活，从而促进侵袭性核因子κB转录因子的激活，最终促进乳腺癌转移[33]。同样，mutp53介导的DAB2IP阻断作用促进胰岛素诱导的磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B通路激活，增强非激素依赖性乳腺癌和前列腺癌细胞的增殖和侵袭[33]。

mutp53的GOF也与mutp53和细胞质中依赖cAMP的蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase，AMPK)的作用有关。AMPK可调节合成代谢和分解代谢之间的平衡，在应激状态下，mutp53优先与AMPKα亚基结合，并抑制AMPK活化，从而影响代谢检查点，增加合成代谢，促进肿瘤的生长与进展[34]。

Yue等[35]的研究表明，mutp53可以与多种人类肿瘤细胞细胞质中单体GTP酶蛋白家族的成员结合，如mutp53可与Rac1结合并激活Rac1。Rac1是一种调节各种细胞增殖,细胞骨架重组以及细胞迁移的小GTP酶。类泛素蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier，SUMO)化对于维持Rac1的活性至关重要，而SUMO特异性蛋白酶1可使Rac1去SUMO化，导致Rac1失活[36]。mutp53与Rac1的相互作用抑制了SENP1介导的Rac1去SUMO化， 从而促进Rac1依赖性的肿瘤的生长和转移[35]。

6 Mutp53的稳定性和激活

结合mutp53的因子也可以促进mutp53稳定和激活，从而驱动mutp53致癌GOF。

6.1Mutp53稳定性的调节因子 Mutp53致癌活性的一个重要条件是在癌细胞中的明显积累。首先，E3泛素连接酶能泛素化mutp53，使mutp53失去致癌活性，而在癌细胞中mutp53能避开E3介导的泛素化，导致大量积累。其次，mutp53通过与MDM2、CHIP以及Cop1结合，控制其自身水平[37]。mutp53通过与HSP90结合，使mutp53蛋白免受CHIP和MDM2介导的泛素化。mutp53与MDM2和HSP90形成三元复合物，DNA损伤后，MDM2被释放，而mutp53保留在HSP90复合物中并免于被降解。因此，该复合物的去稳定化有利于肿瘤细胞中mutp53的降解[38]。此外，HSP70也能结合mutp53，并部分抑制MDM2相关的泛素化。在稳定表达人mutp53的乳腺癌细胞和小鼠胚胎成纤维细胞中，HSP70的高表达促进mutp53-p73-HSP70聚集体的形成，阻碍p73依赖性的细胞凋亡[39]。Bcl-2相关抗凋亡基因2和Bcl-2相关抗凋亡基因5与乳腺癌中的mutp53相互作用，有利于mutp53蛋白的积累和GOF[40]。

6.2Mutp53活性的调节因子 mutp53的活性也可通过翻译后修饰调节。Plk2能调节mutp53的转录活性。在人类细胞模型中，Plk2结合并磷酸化mutp53以响应DNA损伤，促进细胞周期基因上p300-NFY-mutp53复合物的形成，从而有利于肿瘤进展和化学感受。mutp53本身也能诱导转录Plk2，从而加强了此GOF通路[41]。mutp53的功能可通过脯氨酰异构酶Pin1调节。在乳腺癌细胞中，Pin1介导的异构化增强了mutp53的致癌活性，可能是由于Pin1介导的异构化增强了mutp53与TAp63的相互作用，从而增加了mutp53的表达，促进癌细胞增殖和侵袭[24]。 mutp53的致癌功能也受Pontin的调控。Pontin是一种参与多种生物过程如细胞能量代谢、转录、染色质重塑以及DNA损伤反应等的ATP酶，Pontin能促进mutp53介导的多种肿瘤细胞的迁移、侵袭以及相关基因转录的上调[42]。Pin1和Pontin对mutp53的作用相似，它们都可能是开发钝化mutp53 GOF药物的重要靶点。

7 Mutp53与靶向治疗

mutp53的致癌特性和其与其他蛋白质形成复合物的能力密切相关。直接或间接参与DNA转录或信号转导的下游靶点也可以是控制mutp53稳定性和活性的上游调节剂。破坏mutp53复合物的药物可能是治疗癌症的主要靶点，这些药物的作用机制主要包括mutp53结构去稳定以恢复其野生型功能，破坏具有特定靶蛋白的致癌复合物，降低mutp53的积累。

目前已经开发了多种用于mutp53去稳定化、失活或再激活野生型p53功能的化合物。如PRIMA-1(p53 reactivation and induction of massive apoptosis-1)及其类似物PRIMA-1Met可以重新折叠各种p53突变体，恢复野生型DNA结构并诱导细胞凋亡。在动物模型中，PRIMA-1Met能抑制癌症进展，且目前正在临床试验中。 其他小分子，如NSC59984，可以以p73依赖的方式选择性杀死携带mutp53的癌细胞。这些小分子在与mutp53的相互作用中释放p73，促使癌细胞死亡[43]。

也可通过破坏mutp53 GOF中涉及的复合物发挥抗癌作用。如使用嵌合“诱饵”蛋白(GFP-KA2)置换mutp53-DAB2IP复合物。在乳腺癌细胞模型中，这种诱饵蛋白的表达抑制了癌细胞的侵袭、生长和转移[33]。用于干扰mutp53形成异常复合物的肽或核苷酸适体可能在乳腺癌的靶向治疗中也具有一定的作用[34]。防止mutp53与关键转录伴侣(如NFY、SP1、TAp63、p73)相互作用的药物在减缓癌症进展中也具有一定作用。他汀类药物可通过甲羟戊酸途径调节SREBP2-mutp53复合物，从而诱导mutp53降解和功能丧失[15]。在临床前模型中，他汀类药物抑制了携带mutp53的乳腺肿瘤进展。

通过破坏mutp53稳定性和活性，使mutp53蛋白复合物去稳定化，从而治疗肿瘤。在体内肿瘤中，通过17-AAG或Ganetespib阻断HSP90的功能促进了mutp53的降解，有利于诱导细胞凋亡[44]。Ganetespib的功效正在临床试验评估中，其具有良好抗肿瘤前景，特别是在肺癌和转移性乳腺癌中[45]。Pontin特异性ATP酶抑制剂Rottlerin也对含有mutp53的肿瘤产生效应，减少了细胞迁移、增殖以及致癌mutp53靶基因的表达[40]。在临床前乳腺癌模型中，使用特异性Pin1抑制剂能够降低mutp53/Pin1致癌能力，表现出强大的肿瘤抑制作用[46]。

两种以上靶向药物联合使用可增强对mutp53 GOF的干预作用，增加药物的抗癌作用。mutp53-Nrf2复合物能增加蛋白酶体亚基的表达，从而增加乳腺癌细胞中蛋白质的周转[18]。在该模型中，mutp53灭活剂PRIMA-1Met与蛋白酶体抑制剂卡非佐米联合显示出高效率地降低原发性肿瘤的生长和转移[18]。

8 小 结

在大部分乳腺癌中，p53的错义突变导致mutp53蛋白在癌细胞中的累积。大量mutp53失去了野生型p53的肿瘤抑制活性，并与其他转录因子或蛋白质形成异常复合物，也可以通过影响乳腺癌细胞细胞质内的动态平衡和染色体的状态来改变基因表达，最终导致乳腺癌细胞的侵袭性增强，癌细胞生长、转移。现今乳腺癌相关mutp53蛋白质复合物的列表不断增加，致癌表型的数量也在不断增加。mutp53结构去稳定、破坏特定靶蛋白的致癌复合物以及降低mutp53的积累是治疗携带mutp53的乳腺癌的主要途径。详细了解涉及mutp53转录和非转录的复合物是开发新分子靶向药物的重要前提，也是现有药物靶向治疗的重要前提。这些药物可以成为治疗携带mutp53的乳腺癌的新型治疗方案，有利于为患者制定个体化治疗方案，预防性地减少乳腺癌的复发和进展。