PAD4功能的研究进展及临床意义

苟峻琦，刘 茂,唐 锴，帅 壮，吕 湛

(川北医学院附属医院心内科，四川 南充 637000)

肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(peptidylarginine deiminases 4，PAD4)是一种在Ca2+存在条件下可将肽酰精氨酸残基转变为肽酰瓜氨酸残基的修饰酶，是蛋白质翻译后重要的修饰方式之一。PAD4参与多种疾病的发病过程[1]。PAD4首先在白血病中发挥作用而被发现[2]，随后大量的研究发现其可通过直接作用参与肿瘤细胞增殖和转移、自身免疫性疾病以及急性冠状动脉综合征(acute coronary syndromes，ACS)发病过程，同时也可通过促进中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)形成在多种疾病中发挥间接作用[3-5]。NETs由染色质与颗粒蛋白质构成，DNA是NETs的主要结构成分。NETs最初被描述为一种防御细菌的机制[6]，研究发现其在病理血栓形成(包括深静脉血栓形成[7]和动脉粥样硬化血栓形成[8])、自身免疫性疾病的发生、肿瘤的发生中同样具有重要作用。因此，PAD4抑制剂或降解NETs的药物可能成为治疗心血管疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病的新方法。现就PAD4的生物学功能及其临床意义进行综述，期望对PAD4深入研究、相关临床疾病的诊断以及开发新的药物提供帮助。

1 PAD4的结构

Chavanas等[9]将位于染色1p35～36上编码5种人PAD的基因分别称为PAD1～4与PAD6。Nakashima和Hagiwara[2]首先报道从人骨髓白血病HL-60细胞中发现PAD4，其是由663个氨基酸组成的共价二聚体，cDNA为2 238 bp，分子量为74 000。PAD4主要分布于巨噬细胞、粒细胞与单核细胞的细胞质中，作用于细胞核中的组蛋白,它能将带正电荷的组蛋白精氨酸转化为电中性的瓜氨酸残基，进而减弱组蛋白与负电荷DNA的相互作用，使染色质疏松、核膜破裂，释放出松散的染色质和颗粒蛋白，最终形成网状结构。Manjula和Masashi[10]研究发现PAD4是PAD家族中唯一具有核定位模体特性，其能定位于细胞核且在细胞分化、发育和凋亡中发挥重要作用。当PAD4被Ca2+激活时，其能定位于细胞核，以瓜氨酸作用于H3、H2A、H4[6]。PAD4具有两个结构域的伸长折叠，N-结构域由氨基酸残基Met1至Pro300组成，可进一步分化为两个免疫球蛋白样亚结构域(亚结构域1和2)。亚结构域1(残基1～118)具有9个b-片层和1个核定位信号，亚结构域2(残基119～300)有10个b-片层、4个短的α-螺旋和3个Ca2+结合位点。Asn301至Pro663构成C-结构域，C-结构域有5个bbab模块化结构，其结构以一种假五倍体对称结构(称为a/b螺旋片,a/b propeller)环形排列，形成活性位点裂隙。活性位点裂隙能容纳组蛋白N端肽和两个Ca2+结合位点[11]。PAD4是一种依赖Ca2+活性酶，有5个Ca2+结合位点，其与Ca2+结合可引起本身构象改变，形成活性位点裂隙。

2 PAD4的功能

2.1PAD4在ACS中的作用 ACS主要由斑块破裂引起，斑块破裂是动脉粥样硬化斑块内炎症形成的结果，炎症将促进坏死核心的扩张和纤维帽的变薄。目前全世界主要的治疗手段是针对传统的风险因素，如血浆低密度脂蛋白胆固醇水平、吸烟和高血压，蚀损斑块对ACS的影响正在上升。蚀损斑块的特征是内皮细胞脱落和小血管腔内血栓形成，占所有ACS的25%～30%[12]。PAD4通过催化NETs，参与蚀损斑块形成，进而参与ACS发病过程。NETs可与中性粒细胞释放的颗粒蛋结合，从而在动脉粥样硬化、心肌梗死等心血管疾病中发挥重要作用。Wang等[13]研究表明活化的中性粒细胞形成NETs时期，中性粒细胞表达高水平PAD4。Franck等[14]研究发现，经佛波酯(一种抗生素)刺激中性粒细胞产生NETs，用含补体丰富的幼兔血清培养人冠状动脉内皮细胞，用C5b-9染色法检测细胞上补体沉积量。与单独添加幼兔血清相比，添加NETs后，幼兔血清明显增加了内皮细胞凋亡数。这一结果表明，NETs可能以依赖补体的方式促进内皮细胞死亡和脱离。同时，他们还发现血液被急性扰动后，PAD4的缺失或抑制NETs的形成可明显保留内皮屏障功能，防止内皮损伤[15]。Stakos等[16]研究发现，在ST段抬高型急性心肌梗死患者的梗死相关冠状动脉内，参与冠状动脉血栓形成的组织因子的功能需要NETs结构的完整，暴露于NETs上的组织因子，能够诱导凝血酶的产生，产生的凝血酶可以通过细胞蛋白酶活化受体进一步激活静止的血小板，从而参与血栓形成。因此，PAD4和NETs可能破坏内皮的正常功能，从而成为预防和治疗冠状动脉粥样硬化血栓并发症的新靶点。

近年来研究表明，PAD4和依赖PAD4的NETs在人和小鼠动脉粥样硬化形成中发挥重要作用[4]。巨噬细胞分泌细胞因子白细胞介素-1β是动脉粥样硬化发病过程的主要驱动因子，NETs可启动巨噬细胞释放细胞因子，激活Th17细胞，促进动脉粥样硬化斑块中免疫细胞的合成。Liu等[17]研究发现，使用脱氧核糖核酸酶Ⅰ降解形成的NETs,这种方法降低了野生型小鼠体内NETs水平，与未处理的对照组小鼠相比，小鼠体内血管斑块的大小明显减少。Warnatsch等[18]研究证明了NETs参与动脉粥样硬化的作用，他们将载脂蛋白E缺陷小鼠与缺乏中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的小鼠杂交以消除NETs,并给予高脂饮食，主动脉根部横截面积分析显示，两组在高脂饮食治疗4周后差异无统计学意义，但在高脂饮食治疗8周后，载脂蛋白E/中性粒细胞弹性蛋白酶/蛋白酶3缺陷小鼠与仅缺乏载脂蛋白E的对照组小鼠相比，斑块面积减少了75%。同样，给予高脂饮食喂养的载脂蛋白E缺乏小鼠注射脱氧核糖核酸酶Ⅰ，小鼠的斑块面积较前减少了75%。这些实验结果表明，消除斑块部位的NETs或阻止NETs形成可能对动脉粥样硬化有预防或治疗作用。Franck等[14]研究表明，造血细胞中的PAD4基因缺陷并不能影响动脉粥样硬化早期病变脂纹的形成、减少斑块大小或减少炎症反应。他们将8周龄的Ldlr-/-小鼠接受致死性照射，与野生型或PAD4-/-小鼠骨髓重组，给予高脂饮食5或10周后，两组小鼠血液胆固醇水平相似，两组小鼠主动脉的脂质含量比较差异无统计学意义。此外，缺乏PAD4小鼠在高脂饮食5周或10周后，斑块大小并没有改变，也没有改变巨噬细胞聚集。目前，PAD4的这一作用尚存争议，仍需进一步的研究证明。

2.2PAD4在自身免疫性疾病中的作用 近年来，PAD4在多种自身免疫性疾病中得到广泛研究，PAD4抑制剂被认为是治疗自身免疫性疾病的新药物。PAD4可通过促进NETs形成参与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的发病过程[19-20]。PAD4参与中性粒细胞的特殊死亡过程，并形成特殊产物NETs，NETs中含有自身DNA-抗菌肽复合物，激活树突状细胞释放干扰素，刺激自身B淋巴细胞释放针对自身抗原的抗体，促进SLE患者体内炎症反应和病情发展[21]。王增玲等[22]抽取SLE发病期与缓解期患者的静脉血，并用特定试剂检测血清PAD4水平。结果表明，PAD4在SLE患者缓解期和活动期均高表达，明显高于正常对照组。同时，SLE患者肾组织中NETs高表达，浸润的NETs可参与并加速患者肾脏损伤。PAD4在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)中同样发挥重要作用。有学者提出PAD4作为RA特异性较高的一种自身抗原，可作为类风湿因子和抗环瓜氨酸蛋白/肽阴性患者血清学候选诊断指标[23]。PAD4参与RA的发病过程主要是通过瓜氨酸发挥作用[24]。瓜氨酸化参与RA患者自身免疫反应、关节组织侵蚀破坏与血管翳形成。同时，RA患者的关节内分布着瓜氨酸蛋白的靶抗原，导致慢性疼痛和炎症反应。PAD4过表达可引起RA患者滑膜液中PAD4 mRNA、PAD4蛋白和瓜氨酸肽的抗原变性而引起病理免疫反应[25]。吕卓等[26]选取确诊RA的患者活动期24例，缓解期14例，并选取14例正常人作为对照，检测各组静脉血中的PAD4水平。结果显示，RA患者活动期、缓解期PAD4表达水平均高于健康对照组，活动期较缓解期表达升高。Suzuki等[27]研究发现，与野生型的DBAⅠ小鼠相比，牛Ⅱ型胶原免疫PAD4基因敲除小鼠的炎症细胞因子水平、临床疾病评分和抗牛Ⅱ型胶原的抗体水平明显降低，同时牛Ⅱ型胶原可以诱导小鼠体内PAD4的表达，因此，PAD4参与胶原诱导关节炎小鼠的发病过程。

同时，PAD4在多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)、抗中性粒细胞胞质抗体相关性小血管炎等其他自身免疫性疾病中同样具有重要作用。在MS中，髓鞘碱性蛋白是维持髓鞘紧实和防止降解的关键蛋白，其含有非编码氨基酸“瓜氨酸”的浓度和比例异常。PAD4通过催化蛋白质翻译后的瓜氨酸，从而参与MS的发病过程。Wei等[28]选取患有自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型作为模型系统，模拟MS的炎症状态，分别每隔4天注射PAD4的抑制剂，第24天处死小鼠并对脊髓和脑组织进行抗CD3染色，结果在脑组织中治疗组的CD3水平较未治疗组显著降低，脑组织中以CD3为主的T细胞明显减少。这些研究表明，由于抑制了瓜氨酸的作用，经PAD4抑制剂治疗后免疫应答减弱，PAD4酶抑制剂可以作为MS的靶向药物。有研究发现[29]，抗中性粒细胞胞质抗体介导的中性粒细胞活化在体外可诱导NETs的形成，在NETs中存在一些靶向的自身抗原表位，如髓过氧化物酶和蛋白酶3。NETs可以沉积在抗中性粒细胞胞质抗体相关性血管炎患者发炎的肾脏中引起血管炎，促进自身对中性粒细胞成分的免疫反应。总之，PAD4在自身免疫性疾病发病过程中具有重要影响，PAD4酶抑制剂可能具有潜在的治疗作用。

2.3PAD4在肿瘤中的作用 蛋白质瓜氨酸化不仅参与调控基因的表达，与炎症、损伤、凋亡等机体病理生理过程有关，而且在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。PAD4在乳腺癌、直肠腺癌、食管腺癌及卵巢癌等多种肿瘤中高表达[5]。目前研究发现，抑癌基因p53在应激条件下可被激活，其编码的p53蛋白可转录激活与细胞周期停滞、DNA修复和细胞凋亡有关的靶基因(如p21)。PAD4可抑制p53靶基因的表达，从而丧失其抑制肿瘤功能并且激活细胞生长存活通路。而PAD4抑制剂可引起p21表达增加，抑制肿瘤细胞增殖、诱发肿瘤细胞凋亡和周期停滞[30]。在肿瘤细胞中，PAD4可通过上调SESN2(一类抗氧化基因)的表达影响肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长[31]。PAD4可影响肿瘤细胞的凋亡。PAD4在多种非腺癌组织中与细胞角蛋白共表达，细胞角蛋白8、细胞角蛋白18和细胞角蛋白19可被PAD4瓜氨酸化，瓜氨酸化的细胞角蛋白可拮抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白水解酶介导的细胞骨架解聚过程，进而抑制肿瘤细胞凋亡[32]。同时，PAD4抑制剂氟脒或氯脒可对乳腺癌MCF7细胞、白血病HL-60细胞以及人结肠癌HT-29细胞等多种肿瘤细胞产生细胞毒性作用[33]。PAD4还可影响肿瘤细胞的转移和侵蚀。肿瘤及微环境产生的白细胞介素-8在肿瘤细胞生长、侵袭和迁移中发挥重要作用，PAD4可使白细胞介素-8的第5位精氨酸转变为瓜氨酸，瓜氨酸化的白细胞介素-8生物活性将明显下降[34]。同时，晚期肿瘤患者血清中的PAD4可使抗凝血酶瓜氨酸化活性降低，从而使其丧失抑制肿瘤生长、转移以及抗血管生成作用[35]。肿瘤相关性血栓形成同样与PAD4相关，其形成通常伴随有血浆组蛋白高瓜氨酸化。与肿瘤相关的血栓性微血管病患者血浆中的瓜氨酸化组蛋白水平较健康对照组明显升高[36]。

同时，研究发现PAD4催化产生的NETs在多种恶性肿瘤中高表达，并且与治疗效果及预后相关[37]。NETs内多种组分(如基质金属蛋白酶-9、中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G等)可以直接促进肿瘤细胞增殖、血管生成和远处转移[38-41]。NETs可锚定并包裹体内循环肿瘤细胞，从而逃避机体免疫系统对肿瘤细胞的攻击。NETs及其代谢产物还能抑制机体免疫细胞功能[42]。NETs将体内循环肿瘤细胞与内皮细胞锚定，促进内皮细胞与肿瘤细胞的黏附，抑制NETs这种作用可显著减少肿瘤细胞跨内皮渗出和远处转移[43]。NETs也可通过多种途径参与肿瘤相关性血栓形成，循环中的NETs能够为血小板黏附、聚集提供网状支架，其组成成分(核DNA、组蛋白和蛋白酶)具有促凝活性。因此，PAD4抑制剂或降解NETs的药物在肿瘤相关疾病中具有潜在的治疗作用。

3 小 结

PAD4作为PAD家族中唯一具有核定位特性并作用于细胞核组蛋白的酶，是调节NETs产生必不可少的酶。PAD4首先在白血病中发挥作用而被发现，大量研究也表明PAD4在多种类型肿瘤中促进肿瘤细胞增殖、远处转移并参与肿瘤相关性血栓形成。随着对PAD4研究的深入，研究发现PAD4在ACS、自身免疫性疾病中同样具有重要作用。其可在ACS中促进内皮侵蚀、参与血管腔血栓形成和影响动脉粥样硬化，通过直接作用或催化NETs形成，促进病理性免疫性反应形成，从而参与SLE、RA、MS等自身免疫性疾病的发病过程。目前对于PAD4的研究还处于起步阶段，大部分研究为实验性研究，关于PAD4的详细作用机制及其促进NETs形成的具体途径尚未完全明确，有待进行深入研究。PAD4在心血管疾病、肿瘤疾病的作用将是研究的热点，PAD4可能成为开发新一代治疗心血管疾病、肿瘤和自身免疫性疾病药物的新靶酶。