锌、锰单一及复合胁迫对水稻幼苗生理生化特性的影响

严涵，方鑫，朱贤豪，刘星宇，洪阳，刘骏，姚鹏程

(上海市格致中学，上海 奉贤 201499)

锌锰干电池是目前市面上销售量最大的干电池。耗尽电量的干电池随意丢弃影响环境，使土壤遭受严重的重金属污染。锌、锰作为植物生长必需的微量元素，是某些酶不可缺少的组分，也可作为某些酶的激活剂，对植物的生长和新陈代谢都有重要影响[1]。其过量时会对植物产生重金属毒害，从而表现出一系列形态及生理生化反应。一些物种可以通过一定的形式来避免重金属毒害，其中，提高抗氧化系统的酶的活性是植物最重要的耐重金属机理[2]。作为对植物生长有害的重金属，目前关于铝、镉、铅等单一及复合胁迫对植物生长、代谢的毒害及植物产生的抗性机制已有许多报道[3-5]。尽管如锌、锰等植物营养元素过量对植物毒害的研究意义重大，但鲜见关于此方面的报道。本研究通过过量的植物营养元素锌、锰单一及复合胁迫水稻，检测水稻幼苗的生理生化特性，以期阐明锌、锰单一及复合胁迫对水稻的毒害机制，并为评价土壤锌锰重金属污染提供植物生理学指标。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

试验于2018年在上海市格致中学奉贤校区植物逆境生理学实验室进行。供试材料为取自上海市农业科学研究院的龙特甫B水稻种子。选取大小一致的种子，经75%乙醇消毒20 min，用自来水冲洗20 min，蒸馏水冲洗后再用蒸馏水浸种24 h，黑暗催芽24 h，随后播种于含Hoagland营养液的塑料培养盒中，于温室中光/黑各12 h、(28±2)℃下培养。播种前锌以ZnSO4·7H2O形式，锰以MnSO4形式加入至营养液中，形成9个试验组。设空白对照组为T1；处理T2～T4分别为100、150、200 mg·L-1的Zn处理组；T5～T7分别为100、150、200 mg·L-1的Mn处理组；T8～T10分别为100 mg·L-1Zn+100 mg·L-1Mn、150 mg·L-1Zn+150 mg·L-1Mn和200 mg·L-1Zn+200 mg·L-1Mn的复合处理组，对照组与所有试验组均重复3次，pH值6.5，每12 h用1 mol·L-1的HCl或NaOH调节营养液pH。每5 d更换营养液1次，处理20 d。

1.2 测定项目与方法

取3株材料用常规方法测定株高，根长。用排水法测定根系体积，取平均值。取水稻新鲜叶片，采用丙酮法测定叶绿素含量，茚三酮显色法测定游离脯氨酸含量，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸显色法测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用比色法测定。

1.3 数据统计

试验数据均为3次重复的平均值，采用SPSS 20.0软件进行ANVOA方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 水稻幼苗生长状况

处理20 d后水稻幼苗的生长情况(株高、根长、根系体积)结果见表1。

表1 锌锰不同处理下水稻幼苗生长情况

注：同列无相同小写字母表示处理间在5%水平差异显著。表2～3同。

从表1可见，锌、锰单一及复合胁迫下水稻生长均受到抑制。同种重金属胁迫下，抑制作用随着浓度的升高而不断加强。相同胁迫浓度下，单一锌胁迫的抑制强于锌、锰复合胁迫，强于单一锰胁迫。抑制作用最弱的为100 mg·L-1Mn处理组，株高、根长、根系体积分别下降为对照组的81.3%、95.8%、71.5%。200 mg·L-1Zn处理组抑制作用最强，株高、根长、根系体积分别下降为对照组的54.6%、37.2%、32.5%。

2.2 叶绿素含量

由表2可见，锌、锰单一及复合胁迫均显著降低了水稻幼苗叶片中叶绿素的含量。同种重金属胁迫下，叶绿素含量的降幅随着胁迫浓度的增大而增大。相同胁迫浓度下，叶绿素含量的降幅为单一锌胁迫大于锌锰复合胁迫，大于单一锰胁迫。在100 mg·L-1Mn处理组叶绿素含量下降最少，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量分别为对照组的82.9%、70.1%、78.8%。在200 mg·L-1Zn处理组叶绿素含量下降最多，其中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素分别为对照组的54.1%、35.4%、48.1%。由叶绿素a/b数据可知，叶绿素b的降幅高于叶绿素a。

2.3 游离脯氨酸含量

锌、锰单一及复合胁迫均导致水稻幼苗叶片中游离脯氨酸含量上升(图1)。同种重金属胁迫下，随着离子浓度的升高，水稻幼苗叶片中游离脯氨酸含量逐渐升高。相同胁迫浓度下，单一锌胁迫对水稻幼苗游离脯氨酸含量上升幅度大于锌锰复合胁迫，大于单一锰胁迫。200 mg·L-1Zn处理组，游离脯氨酸含量上升最多，100 mg·L-1Mn处理组，游离脯氨酸含量上升最少，相比对照组分别升高42.7%和7.2%。

图1 锌锰单一及复合胁迫对水稻幼叶中游离脯氨酸含量的影响

2.4 MDA含量和SOD活性

处理20 d后，水稻幼苗的叶片出现明显的坏死斑及黄化现象。这与叶片中MDA含量上升有直接关系。同种重金属胁迫下，离子浓度越高，叶片黄化现象越严重，与表3中MDA含量相对应。相同浓度下单一锌处理组MDA积累量最大，单一锰处理组积累量最小。在200 mg·L-1处理组，单一锌胁迫MDA积累量达到对照组的1.70倍，单一锰胁迫处理组为对照组的1.22倍，小于单一锌胁迫100 mg·L-1处理组(1.44倍)。

锌、锰单一及复合胁迫均显著降低叶片中SOD的活性，且同种重金属胁迫下，SOD活性随着胁迫浓度的升高而降低，相同浓度下单一锌胁迫对水稻幼苗叶片SOD影响最大，锌锰复合胁迫其次，单一锰胁迫最小。200 mg·L-1Zn处理组SOD活性下降最多，100 mg·L-1Mn处理组SOD活性下降最少，与对照组相比，分别下降48.3%和10.3%。

表3 锌锰单一及复合胁迫对水稻幼叶中MDA和SOD活性的影响

3 讨论

Zn、Mn是植物生长的必需元素，其过量会对植物的生长产生毒害。在相同浓度下，单一锌胁迫的毒害效应大于锌锰复合胁迫，大于单一锰胁迫。可见，水稻对锰的耐受程度高于锌。而相同浓度下锌锰复合胁迫的毒害效应小于单一锌的毒害，这可能和Mn2+的加入抑制了Zn2+对植物的毒害有关，因此两者对水稻的胁迫存在一定的拮抗效应。

本研究显示，单一锰胁迫对水稻叶绿素合成的影响显著低于单一锌胁迫。这可能是由于锌是叶绿体中碳酸酐酶的主要成分[6]，但当锌过量时则显著提高了植物过氧化氢酶和愈创木酚过氧化物酶的活性，导致含氧自由基大量产生，叶绿体膜脂过氧化，叶绿体内膜结构遭到破坏，使叶绿素的氧化分解加快[7]。此外，当锌局部积累时，会与叶绿体蛋白质中的-SH结合，或者取代其中的Fe2+、Mg2+，使得叶绿素含量降低[7]。当锌、锰复合胁迫水稻幼苗时，Mn2+、Zn2+竞争与叶绿体蛋白质中的成分发生反应，从而降低了Zn2+对水稻的毒害。

作为细胞的一种渗透调节机制，环境胁迫会导致脯氨酸积累已被许多研究证实[8-10]。本研究的锌、锰单一及复合胁迫条件下水稻幼苗叶片中脯氨酸都发生了积累，与之前的研究一致。脯氨酸的积累可能是由于水稻受到环境胁迫导致其合成量增大所致[11]。因为脯氨酸可以作为溶质保护生物大分子结构不被破坏，也可以减少由于环境胁迫引发的自由基积累[12]。本研究中各个处理组游离脯氨酸积累的趋势与叶绿素含量降低的趋势相同，因此，可将游离脯氨酸的积累量作为胁迫指标进行胁迫程度的判定。

脂质过氧化是植物在逆境胁迫下最典型的症状[13]。MDA是脂质过氧化的产物，可反映植物的受胁迫程度[14]。本研究中锌、锰单一及复合胁迫水稻表现出叶片坏死及黄化，且浓度越高，叶片坏死与黄化现象越严重。叶片中MDA含量也相应的大幅上升，表明胁迫导致水稻脂质过氧化水平提高，产生了大量自由基，这与胁迫导致水稻叶绿素含量下降的机制类似。

为了抵御自由基产生的氧化胁迫，植物会启动抗氧化系统，如SOD、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)等[14]的含量发生变化。其中SOD即是植物抗氧化系统中一种重要的酶，可催化O2-转化成H2O2。Zn、Mn元素是植物体内Cu、Zn-SOD，Mn-SOD的组成成分。缺少这两种元素，SOD活性会明显下降[15]。本研究发现当这两种元素过量时抑制了SOD的活性，这与邵邻相等[16]的研究结论一致，表明胁迫处理的水稻并不能持续提高SOD活性以适应逆境。

目前，Zn-Mn干电池随意丢弃导致的土壤重金属污染问题已受到越来越多人的重视。在对干电池使用进行干预的同时，如何对已污染的土壤进行治理也是亟待解决的问题。笔者认为可依据本研究涉及到的指标进行Zn、Mn耐受水稻品种的筛选，种植于重金属污染的土壤中用于缓解污染。