超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肝中3种β-受体激动剂残留

沈东强，刘标

(湖州市农产品质量管理站，浙江 湖州 313000)

β-受体激动剂是一类人工合成的苯乙醇胺类物质，又称“瘦肉精”，能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长[1-3]。β-受体激动剂在动物性食品中的残留时间较长，会严重影响人类健康。因此，我国农业部第196号和235号公告均禁止β-受体激动剂类药物作为饲料添加剂用于畜牧业。

目前，有关报道的动物源性食品中β-受体激动剂残留检测的方法主要有酶联免疫法(ELISA)[4-6]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[7-9]和液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)[10-13]。ELISA法无法精准定量，GC-MS法需要衍生，步骤繁琐，且不适用于多种目标物的同时测定，HPLC-MS/MS法无需衍生、检出限低、灵敏度高，但前处理过程比较复杂。本文在现有的基础上，优化了前处理步骤，采用岛津超高效液相色谱仪(LC-30A)和三重四级杆串联质谱仪(LCMS-8050)联用技术测定β-受体激动剂药物残留，分析准确，效率高，为当前β-受体激动剂检测领域提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-30A超高效液相色谱仪、LCMS-8050三重四级杆串联质谱仪，日本岛津公司；N-EVAP氮吹仪，美国Organomation公司； T25匀浆仪，德国IKA公司；SKY-110WX水浴摇床，广州沪瑞明仪器有限公司；MS1涡漩式混合器，上海珂淮仪器有限公司。

甲醇(色谱纯)，甲酸(色谱纯)，水(超纯水)，Oasis MCX阳离子交换柱(60 mg·(3 mL-1))。克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥99%，莱克多巴胺-D3购自加拿大CDN isotopes公司，纯度≥98%。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制

标准物质分别为克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇。用甲醇配制成1 μg·mL-1混合标准储备溶液，-18 ℃避光保存。临用时，用0.1%甲酸水溶液将1 μg·mL-1混合标准储备溶液依次稀释成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μg·L-1浓度的混合标准工作液。

同位素内标物分别为克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3。用甲醇配制成100 μg·mL-1的混合内标储备液，-18 ℃避光保存。临用时，用0.1%甲酸水溶液将100 μg·mL-1混合内标储备液进行适当稀释。

1.2.2 样品前处理

准确称取2.0 g(精确至0.01 g)经捣碎的猪肝样品于50 mL离心管中，加入250 μL 100 ng·mL-1内标液和8 mL 0.2 mol·L-1pH值5.2乙酸铵溶液，充分混匀，再加入50 μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶溶液，振荡混匀后，37 ℃水浴水解16 h后取出冷却，10 000 r·min-1离心5 min，取出上清液，下层溶液中加入8 mL 0.1 mol·L-1高氯酸溶液，振荡提取2 min，10 000 r·min-1离心5 min，合并2次上清液，混匀，待净化。

依次用3 mL甲醇和3 mL水活化MCX固相萃取柱，然后取上清液过柱，弃去滤液，再依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，弃去滤液，最后用2.5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，45 ℃氮吹吹至近干，用0.1%甲酸水溶液定容至5 mL，漩涡混匀1 min，过0.22 μm有机相滤膜，供HPLC-MS/MS分析。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Shim-pack GISS C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.9 μm)；柱温：40 ℃；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：甲醇；流速0.3 mL·min-1；进样体积10 μL。

梯度洗脱，B相初始浓度3%，洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.4 质谱条件

离子源为电喷雾离子源(ESI+)，离子源接口电压4 kV，雾化气为氮气(3.0 L·min-1)，干燥气为氮气(10 L·min-1)，碰撞气为氩气，脱溶剂管温度250 ℃，加热模块温度400 ℃，接口温度300 ℃，喷雾针距离1.0 mm，扫描模式为多反应监测(MRM)，驻留时间100 ms，MRM 参数见表2。

表 2 MRM 参数

注：*表示定量离子对。

2 结果与分析

2.1 线性范围

将浓度0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·L-1的混合标准工作液进行测定，内标法定量。以待测物与内标物的浓度比为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，线性方程及相关系数见表3。

2.2 精密度

配制0.2、0.5、5.0 μg·L-1浓度β-受体激动剂标准溶液，平行测定6次，3种化合物的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.018 0%～0.089 7%和0.67%～3.41%，结果表明仪器精密度良好(表4)。

表4 重复测定的精密度

2.3 灵敏度

配制0.1μg·L-1β-受体激动剂的标准溶液进样，根据S/N=3和10计算检出限和定量限(表5)。

2.4 回收率

取猪肝样品，添加3个浓度做回收实验，平行4次，结果显示见表6。

表5 0.1μg·L-1 β-受体激动剂的灵敏度实验

表6 加标回收实验结果

3 小结

本研究建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪(LC-30A)和三重四级杆串联质谱仪(LCMS-8050)联用测定猪肝中3种β-受体激动剂的方法。考察了甲醇和乙腈作为流动相，甲醇分离度和灵敏度都高于乙腈；考察了PCX小柱和MCX小柱的净化效果， MCX小柱能更大程度地去除杂质，达到更好的净化效果。综上，通过方法验证，符合现有标准的要求，操作简单，灵敏度高，效率高，可用于动物源性食品中β-受体激动剂的日常检测。