中性粒细胞外陷阱在炎性疾病中的作用

李彩莹，梁雨亭，王 丹，塔 娜，赵德超

(哈尔滨医科大学附属第一医院心内科， 哈尔滨 150001)

中性粒细胞是机体抵御病原体入侵的第一道免疫防线，是非特异性免疫的重要组成部分。中性粒细胞是最早到达炎症部位的免疫细胞，通过吞噬、释放杀菌颗粒、产生细胞因子等方式消灭并防止病原微生物在体内扩散[1]。除以上方式外，中性粒细胞还存在另一种免疫防御机制——中性粒细胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs是中性粒细胞活化后释放的由细胞质和颗粒蛋白组成的胞外网状结构，是一种新型的抗微生物机制。目前认为NETs是先天性免疫反应的一种形式，不仅可以捕获、杀灭以及阻止细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原微生物的扩散，还可导致超炎症病理学[2]，在感染性疾病中具有重要作用。研究发现，炎症、痛风、类风湿关节炎(rheumatoid arthitis,RA)、系统性红斑狼疮、小血管炎等非感染性炎性疾病与NETs过量产生或清除障碍密切相关[3-5]。现从NETs的形成、抗菌性及其在炎性疾病中的意义等进行概述。

1 NETs概述

1.1NETs的组分及效应 NETs是中性粒细胞受刺激,核内染色质解聚后释放到胞外的网状结构，面积是浓缩染色质的3～5倍，其以DNA为骨架，上镶嵌有组蛋白以及超过30种初级和次级颗粒组分[6]，其中一些组分具有杀菌活性，如弹性蛋白酶、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、组织蛋白酶G、乳铁蛋白、穿透素3、明胶酶、蛋白酶3、抗菌肽、肽聚糖结合蛋白等[7]，这些镶嵌在DNA骨架上的蛋白增强了NETs的抗微生物作用，可作为生物酶和杀菌剂，其被释放到组织和血液时，能够引起炎症反应和血栓形成，从而加重宿主损伤。在炎性相关的自身免疫性疾病中，NETs组分也可作为抗原诱导免疫反应[8]。因此，NETs在炎性疾病中的效应具有双重属性。

1.2NETs形成机制和影响因素 中性粒细胞胞外诱捕网是区别于凋亡和坏死的另一条细胞死亡途径，随后对其进行了详细研究，并命名为NETosis。病原微生物、脂多糖、佛波酯、活化的血小板等都能诱导中性粒细胞产生NETs。有报道指出，组织损伤引起全身炎症反应的患者的血浆也可以刺激中性粒细胞释放NETs，其原因可能与血浆中白细胞介素(interleukin，IL)-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等炎症细胞因子表达的增多有关[9]。

目前，NETs产生的分子机制尚未完全清楚。已知的NETosis有3种模式:①自杀性NETosis，持续2～4 h，是目前了解的最多的一种模式[10]。应用佛波酯刺激中性粒细胞后激活还原型辅酶氧化酶复合物，促进活性氧的生成。同时细胞质内Ca2+增加,其作为肽基精氨酸脱氨酶4的辅因子，加速组蛋白瓜氨酸化及染色质解聚[8]。活性氧作为自杀性NETosis的第二信使，能促进核膜裂解。此外，嗜天青颗粒释放的弹性蛋白酶和MPO进入细胞核，促进染色体解聚并进入细胞质，然后与胞质蛋白和颗粒毒素结合释放到细胞外[9]。活性氧的产生和肽基精氨酸脱氨酶4诱导的组蛋白瓜氨酸化是自杀性NETosis的关键。②细胞核DNA释放式NETosis模式，此过程持续5～60 min，不伴有核或质膜的破坏，且不依赖于活性氧的产生。NETosis发生后，中性粒细胞仍能够吞噬病原体，且其寿命不会因为DNA损伤而受影响。③线粒体DNA被释式NETosis， 此过程依赖活性氧的产生，中性粒细胞受到C5a或脂多糖刺激15 min内80%会形成NETs[9]。

1.3NETS的检测 NETs的检测分为定性检测和定量检测，目前主要进行定性检测。佛波酯刺激中性粒细胞后，透射电子镜下可观察到细胞核和颗粒的崩解；也可用单克隆抗体标记抗组蛋白-DNA复合物、MPO，或采用特殊染料二脒基苯基吲哚和SYBR Green对核酸进行染色，在荧光共聚焦显微镜观察到荧光现象可证实NETs的产生[11]。

有研究报道了一种灵敏度高且可自动化检测NETs的定量方法，其采用Sytox green对人中性粒细胞的PKH26和胞外DNA进行标记，然后将细胞固定并使用三维共焦激光扫描显微镜成像，最后使用数字图像分析量化NETs的释放[12]。此外，还可应用PicoGreen dsDNA Quantitation kit对血浆、血清中NETs的水平进行定量检测[13]。

1.4NETs的抗感染作用 中性粒细胞是感染早期发挥免疫效应的主力细胞，被刺激后释放的胞外网状结构可捕捉病原体，同时也可帮助其他细胞发挥吞噬作用，其上附着的大量抗菌蛋白可以杀灭病原体[3]。NETs经脱氧核糖核酸酶Ⅰ(desoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ)处理会失去灭菌作用，因此DNA结构对杀灭病原体有核心作用[10]。NETs包含的DNA和组蛋白具有内在的抗微生物活性，DNA作为阳离子螯合剂，能够破坏铜绿假单胞菌的外膜和内膜[14]。组蛋白2A被认为是最有效的抗微生物剂之一，特别是对大肠埃希菌、志贺菌属、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等效果显著。组蛋白的抗微生物作用不仅针对细菌，对寄生虫同样有效。NETs还可通过分解细胞因子和炎症趋化因子减轻炎症反应，通过促凝血限制病原体扩散[11,15]。长久的进化压力也使一些病原体产生了一些逃避NETs的机制。有研究发现，病原体可通过改变表面电荷躲避NETs的捕捉[16]。肺炎链球菌产生的毒力因子能够降解NETs的DNA骨架，帮助肺炎链球菌从NETs上逃脱，促进细菌从上呼吸道传播到肺，然后向血液扩散。

2 NETs与感染性疾病

2.1NETs与细菌感染 细菌、病毒、寄生虫以及真菌都可以诱导炎症过程，因细菌及其代谢产物是第1个发现可以诱导NET形成的病原体，因此研究的较为深入。金黄色葡萄球菌是一种革兰阳性菌，由于其具有逃避免疫系统、抵抗抗生素治疗的能力而被称为“超细菌”，能引起诸如骨髓炎、心内膜炎、菌血症等严重的炎症反应。在Brinkmann等[3]的试验中，金黄色葡萄球菌首次被用作NETosis的刺激物。NETs可捕获病原体，并阻碍其扩散，发挥抗菌作用。在局部感染的早期阶段或脓毒症中，NETs的诱捕功能可能有助于脓肿的形成，并限制病原体传播。一旦失去NETs的遏制，会导致疾病进展。Thmmavongsa等[17]报道，金黄色葡萄球菌诱导产生的NETs对巨噬细胞有细胞毒性作用，可以诱导细胞死亡；金黄色葡萄球菌还可以分泌毒性因子，逃避宿主免疫系统。因此，NETs与呼吸系统继发感染导致的疾病进展(如慢性阻塞性肺疾病、肺炎等)以及并发症等相关[16]。

大肠埃希菌是一种革兰阴性细菌，与很多疾病如肠炎、尿路感染、脑膜炎、败血症等的发病相关[18]。Czaikoski等[19]发现，大肠埃希菌引发的脓毒性休克患者的血清能刺激中性粒细胞，显著诱导NETs的生成。Marin-Esteban等[20]研究婴儿腹泻时发现，NETs能够捕获、固定以及杀灭细菌，但当中性粒细胞与上皮细胞系CaCo-2/TC7及细菌共同培养时，中性粒细胞能产生NETs，并损害上皮细胞。因此认为NETs能够损伤肠上皮，并与其他肠道炎性疾病相关。

2.2NETs与病毒感染 NETs在抗病毒反应中的作用尚不清楚。最近的研究才开始阐明中性粒细胞参与宿主抗病毒反应的效应机制。尽管涉及抗病毒活性的几个因子(包括MPO和α-防御素)在NETs中表达，但很少有研究描述NETs在病毒清除中的作用。Hoeksema等[21]报道，组蛋白对流感病毒感染具有保护作用，具体表现为富含精氨酸的组蛋白具有针对季节性H3N2和H1N1的强效抗病毒活性，可通过与病毒颗粒直接作用，进而抑制病毒的摄取和复制。研究发现，人类免疫缺陷病毒颗粒被NETs捕获后黏附在网状结构上，从而阻止病毒传播，增加了NETs杀伤微生物组分的时间；此外人类免疫缺陷病毒诱导NETs生成的过程中，Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)8与TLR7的衔接诱导了活性氧的产生[22]。在呼吸道合胞病毒引起的下呼吸道严重疾病患者的支气管肺泡灌洗液中也发现了NETs的存在，NET的形成可以防止呼吸道合胞病毒传播，但却无法杀死病毒；此外，呼吸道合胞病毒F蛋白也能通过TLR4诱导NETs，而这些NETs作为病毒储存库，其存在可能会加剧炎症反应，促进气道闭塞[23]。总之，NETs具有监控病毒并阻止其扩散以及感染靶细胞的作用。

2.3NETs与其他病原体感染 真菌也可以诱导NETs的生成。新型隐球菌是一种机会性致病真菌，可导致隐球菌病和脑膜脑炎。新型隐球菌的荚膜多糖赋予其调节宿主免疫系统的能力，特别是能调节NETs的生成，荚膜酸性多糖通过抑制NETs的产生增强菌株的毒力[24]。弓形虫是弓形体病的病原体，因摄入受污染的食物而致病。弓形虫感染可诱导中性粒细胞向感染部位募集。在鼻内感染的小鼠模型中，中性粒细胞通过NETs捕获和消灭病原体，并限制病原体的传播[25]。

3 NETs与非感染性炎性疾病

3.1痛风 痛风是一种自身炎性疾病，其特征是关节中沉积的尿酸单钠晶体吸引白细胞形成的痛风石介导的组织损伤。尿酸单钠晶体可以刺激中性粒细胞分泌IL-8、TNF-α以及IL-6，这些细胞因子不仅能促进中性粒细胞募集，还能诱导NETs形成。与其他疾病一样，NETs可促进痛风的炎症反应[26]；与其他疾病不同的是，NETs在终止痛风发作中也具有重要作用。首先，NETosis预示了中性粒细胞的死亡，因此降低了中性粒细胞的密度；其次，NETs特有的网状结构封闭了尿酸单钠晶体，保护其免受吞噬；最后，NETs衍生的蛋白酶可使细胞因子失活，并消除其促炎效应[27]。

3.2RA RA是一种导致关节软骨和骨损伤的持续性滑膜炎，也是一种全身性自身免疫性疾病。RA患者的滑膜液中浸润了大量可以形成NETs的中性粒细胞，且RA患者外周血中中性粒细胞也较健康受试者更易产生NETs[28]。与其他自身免疫性疾病一样，NETs也可能是细胞外自身抗原的来源,如在RA患者的滑膜中可检测到组蛋白瓜氨酸化产生的瓜氨酸化肽在中性粒细胞的过表达。此类瓜氨酸化肽能被α-瓜氨酸肽抗体识别，形成诱导NETs形成的免疫复合物，导致中性粒细胞颗粒以及胞质自身抗原在关节的释放[29]。中性粒细胞颗粒以及胞质自身抗原也可释放核因子κB配体和B细胞激活因子受体激活剂，分别激活破骨细胞和B细胞，在关节中诱导过度免疫反应和组织损伤[30]。RA患者的血清中α-瓜氨酸肽抗体在疾病的早期阶段，甚至在临床症状出现前就能检测到，是RA的早期生物标志物。Khandpur等[28]发现，除NETs诱导的自身抗体外，IL-17和TNF-α也具有这种能力，并且这些细胞因子在RA患者的血清中过表达。

3.3系统性红斑狼疮 系统性红斑狼疮是一种自身免疫性炎性疾病，以浆样树突状细胞的激活和自身抗体的产生为特征。NETs参与了系统性红斑狼疮的病理过程。在系统性红斑狼疮患者的体内，来自NETosis和凋亡细胞的核酸物质因清除失败而沉积在患者体内，这些自身抗原通过滤泡树突状细胞呈递给次级淋巴器官生发中心的自体反应性B细胞，产生针对NETs细胞成分的自身抗体[31]。产生的免疫复合物可通过Ⅱ型Fcγ受体介导的胞吞作用，通过TLR7和TLR9途径激活浆样树突状细胞分泌IFN-α，刺激更多的NETs产生，同时也可激活补体系统，并诱导炎症、血管损伤以及血栓形成等[32]。研究证实，狼疮性肾炎的进展可能与体内存在DNaseⅠ抑制剂以及与NETs结合的自身抗体，导致机体清除NETs的能力下降有关[33]。

3.4小血管炎 小血管炎是一种病因不明的全身性疾病，是影响小动脉、小静脉以及毛细血管的炎症[32]。在大部分小血管炎患者中可检测到抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)，长期接触NETosis释放的蛋白质如MPO、蛋白酶3、组蛋白等是产生ANCA的主要原因，这些蛋白可促进炎症介质激活补体系统，并导致内皮损伤。NETs中的MPO和蛋白酶3是ANCA的特异性靶抗原，这使免疫系统陷入一个恶性循环，使炎症持续存在。另外，高水平的DNA-MPO复合物与疾病活动相关，α-蛋白酶3和α-MPO ANCA在疾病活动期间诱导NETosis，也可使免疫系统陷入恶性循环，加重小血管炎患者病情[33]。

3.51型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM) T1DM是一种自身免疫性疾病,先天免疫应答细胞在其发病中起重要作用。在被炎症细胞浸润的胰腺中发现的中性粒细胞和树突状细胞等能合成α干扰素和活性氧，进而促进促炎症细胞因子的合成[34]。在糖尿病患者中，TNF-α升高激活中性粒细胞形成NETs，进而释放中性粒细胞丝氨酸蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶以及蛋白酶3等细胞内容物[34]。因此，T1DM患者血清中中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的水平和酶活性均升高，而它们在IFN-α、IL-1β、IL-18的成熟和释放以及TLRs的表达和活化中均有重要作用[35]。中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3在T1DM发病中也起着重要作用，其能促进中性粒细胞募集到炎症部位，形成负反馈，促进自身免疫性糖尿病的发生。研究表明，T1DM患者和存在患病风险的个体均患有中性粒细胞减少症，其原因可能部分归因于NETosis的增加和胰腺组织中中性粒细胞的浸润[35]。炎症急性期可抑制组织修复，因此NETs促进炎症和组织破坏的作用可以解释其延缓糖尿病患者切口的愈合。NETosis需要葡萄糖提供能量，因此糖尿病患者的中性粒细胞更易释放NETs，这可能与血糖升高对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和线粒体的影响引起活性氧爆发有关，但更高的血糖水平会抑制NETosis[36]。

4 NETs与其他疾病

在子痫前期、血栓性疾病、肿瘤等多种疾病中均有NETs的生成。研究显示,NETosis在肿瘤的发生、发展中具有重要作用，因此推测DNaseⅠ治疗可能对肿瘤有效[4,37]。在胰腺癌中也检测到了NETs的存在，发现DNaseⅠ治疗可减轻炎症并抑制肿瘤生长[37]。血栓形成也与NETs相关，NETs中的核苷酸、酶类物质均为促凝成分，组蛋白有助于血栓形成并促进组织因子产生，同时激活凝血酶。在小鼠模型中已证实活化的血小板可刺激NETs生成，并引起深静脉血栓形成[38]。在动脉粥样硬化的早期炎症阶段，微小的胆固醇晶体可诱导NETs生成，斑块中的巨噬细胞可促进炎症反应并活化血小板，加重动脉斑块病变引发的血管卒中事件[39]。近年来，在多种心血管疾病中已证实有NETs的生成，且其发生与炎症反应、血液高凝状态有关[15]。对小鼠阿尔茨海默病模型的研究发现，中性粒细胞的消耗或阻断中性粒细胞募集可促进阿尔茨海默病小鼠的病理学改善，同时改善认知功能[40]。然而，NETs是否以及如何影响神经元变性还有待进一步研究。

5 结 语

中性粒细胞是机体重要的免疫细胞，在机体抗感染免疫反应中至关重要。随着对中性粒细胞研究的进一步深入，NETs作为中性粒细胞的一种新型抗菌方式，一直处于中性粒细胞生物学研究领域的前沿。NETs不仅在炎性疾病的发病中发挥重要作用，同时也在众多非感染性炎性疾病中担任重要角色，但目前关于NETs的分子机制和信号通路仍不十分明确。总结NETs在疾病中的作用有助于更好地理解NETs与一些疾病的关系，为疾病的预防和治疗提供提新的思路。