非编码RNA对冠心病发生发展影响的研究进展

李 平，庞 智，朱剑云，孙琛琛，孙康云

(南京医科大学附属苏州医院心血管内科 苏州市消化系疾病与营养研究所，江苏 苏州 215008)

冠心病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，常常被称为“冠心病”。动脉粥样硬化是心血管疾病的主要形式，是炎性斑块和包含多种复杂相互作用的不同类型的细胞和修饰脂蛋白沉积在动脉壁内的慢性炎症反应[1]。近年来我国居民冠心病及急性心肌梗死死亡率呈快速上升趋势，农村上升更为明显。主要原因是高血压、高胆固醇血症等主要危险因素持续升高，知晓率、治疗率及控制率虽有升高，但仍处于较低水平[2]。男性、肥胖、吸烟、糖尿病、高血压、高血脂以及相关遗传因素等危险因素与冠心病的发生相关。目前针对冠心病的诊断方法主要依靠临床医师的经验、物理诊断和临床生化指标实验诊断。早发冠心病易感基因和特征性炎症介质的研究成果使冠心病易感人群的大规模筛选具有了可能性，也有利于冠心病预防的关口前移，这是近年国内外研究的热点之一。

全球性的转录分析发现66%的基因组被转录，其中80%是呈现活性转录的生物化学标记，然而不到2%的能够编码蛋白质[3]。绝大多数非编码的调控元件被转录成非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)[4]。近年来，ncRNAs作为冠心病早期诊断血液标志物的研究已成为当前的研究热点，现从ncRNA入手，对近几年的研究进展进行综述。

1 微RNA与冠心病的关系

微RNA(microRNA，miRNA)是一种小型(19～25 nt)单链ncRNA，转录后调控基因表达，在细胞代谢、分化、增殖和凋亡等多种生物过程中起着至关重要的作用[5-6]。研究发现，miRNA具有组织特异性，并且与心血管系统生理及病理变化相关[7]。此外，由于miRNA片段较小，在体液中能够稳定检测到，并且能够耐受内源性RNA酶的降解作用[8]。这些优势使得miRNA能够成为心血管疾病早期筛查比较理想的生物标志物之一。

近几年，关于miRNA的研究非常多，在冠心病患者中发现了许多与健康对照组差异表达的miRNA。研究发现，这些与冠心病疾病相关的miRNA，通过影响脂质代谢，血管内皮细胞的增殖、凋亡，炎症反应以及端粒长度来影响冠心病的发生发展。

1.1脂质代谢相关miRNA与冠心病 miR-370在脂类代谢中起关键作用，能够下调肉碱棕榈酰转移酶1α基因的表达从而控制脂肪酸氧化作用[9]。取临床95例冠心病患者和50例健康组血浆，使用实时荧光定量聚合酶链反应法进行比较，发现miR-370在冠心病患者中较正常人表达量明显升高[10]。miR-24与体内油脂的积累以及高三酰甘油血症密切相关，在早期和晚期动脉粥样硬化斑块中被公认为特异性miRNA[11]。miR-33a被认为是维持细胞胆固醇稳态的关键后转录调控基因，与脂肪酸氧化的重要基因如胆固醇运输基因ATP结合盒转运蛋白A1、腺苷三磷酸结合盒亚家族G1抗体和尼曼-皮克病C1型相关联[12]。miR-103a参与细胞辅酶A和脂质代谢途径[13]。miR-122调节与脂质合成及氧化相关的基因包括固醇调节元件结合蛋白、微粒体三酰甘油转移蛋白、Krupple 样因子6和阳离子氨基酸转运蛋白基因，沉默miR-122会导致血浆中总胆固醇和三酰甘油水平降低。运用实时荧光定量聚合酶链反应法检测161例临床冠心病患者和150例健康组单核粒细胞中miRNA的表达水平，发现miR-24、miR-33a、miR-103a和miR-122在冠心病患者中表达量高于健康组[14]。50例家族性高胆固醇血症患者血浆中miR-130a-3p表达水平较24例健康组下调，另外，miR-130a-3p与冠状动脉粥样硬化程度呈负相关[15]。

1.2细胞增殖、凋亡相关miRNA与冠心病 miR-206在冠心病患者血浆和患病的内皮祖细胞中表达量均较高，miR-206能够明显抑制冠心病患者内皮祖细胞的生存和侵入能力，增加内皮祖细胞的凋亡。并且发现miR-206能够抑制血管内皮生长因子的表达[16]。同时，miR-126能够通过上调血管内皮生长因子的表达来调节血管的完整性和血管发生，并且在小鼠体内进行miR-126敲除会导致血管的渗漏[17]。在82例冠心病患者血浆中miR-126表达量明显较42例健康组低[18]。研究发现，在冠心病患者的血清和血管平滑肌细胞中，miR-574-5p的表达水平较高。另外，miR-574-5p通过抑制ZDHHC14(zinc finger DHHC-type containing 14)基因的表达来促进细胞增殖和抑制细胞凋亡[19]。miR-362-3p抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，阻碍了细胞G1/S周期的转变。生物信息学分析表明，miR-362-3p与血栓形成的一种分离蛋白和金属蛋白酶凝血酶敏感素1型基序的解聚素样金属蛋白酶结合，能够抑制其mRNA和蛋白的表达，在110例冠心病患者血浆中miR-362-3p表达量较84例健康对照明显下调[20]。与正常的冠状动脉组织相比，miR-448在冠状动脉粥样斑块的血管平滑肌中表达上调，肌细胞增强因子2C过表达降低了miR-448诱导的血管平滑肌细胞的增殖和迁移[21]。冠心病患者内皮祖细胞功能失调，是由循环miR-146a和miR-146b在心血管中的负反馈循环引起的。研究表明，miR-146a-5p和miR-146b-5p与许多血管生成相关的基因关联，这些基因在冠心病患者内皮祖细胞中下调表达[22]。研究结果显示，在冠心病患者中miR-939表达下调。miR-939通过靶向γ联蛋白来抑制血管生成，破坏了血管的完整性。在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中过表达miR-939能够明显抑制细胞增殖、黏附和血管生成，但是会增加细胞的迁移[23]。miR-133a的转录浓度梯度增加与急性冠状动脉综合征患者的病死率增高有关，而且增加了稳定的冠心病患者支架内再狭窄新的血管化发生率[24-25]。miR-499在216例冠心病患者中较90例健康组中上调表达，下调表达miR-499能够通过抑制肿瘤坏死因子-α激活核因子κB信号通路来保护冠心病内皮细胞免受炎症的损害[26]。miR-20a在冠心病患者中较健康组下调表达，能够特异性结合人第10号染色体缺失的磷酸酶的3′非翻译区，通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路来增加血管内皮细胞的成活和增殖[27]。

1.3炎症反应相关miRNA与冠心病 与内皮细胞相关的miR-126也能够通过介导细胞间黏附因子1的白细胞浸润来抑制血管的炎症反应[28]。在冠心病患者中miR-22在外周血单核细胞中下调表达，miR-22可以通过负调控单核细胞趋化蛋白1靶向参与炎症反应从而导致冠心病的发生[29]。血清中miR-21水平与内脂素水平呈正相关，急性冠状动脉综合征患者血清miR-21水平明显高于稳定冠心病患者，血清miR-21和内脂素的增加可能促进急性冠状动脉综合征的炎症反应，也可能来自急性冠状动脉综合征的炎症反应。此外，miR-21和内脂素在斑块不稳定性和炎症中的潜在作用还值得进一步研究[30]。在动脉粥样硬化的炎症反应中，miR-10a与血清白细胞介素-10水平呈正相关，与健康组相比，miR-10a在冠心病患者组表达下调[31]。

1.4端粒相关miRNA与冠心病 端粒重复结合因子在端粒的维持中起重要作用，miR-23a可以直接抑制端粒重复结合因子的表达，从而诱导端粒缩短和细胞衰老。高水平的miR-23a通过下调端粒重复结合因子的表达，诱导端粒缩短，与冠状动脉疾病患者的临床预后不良有关[32]。

2 长链非编码RNA与冠心病的关系

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度>200 bp的ncRNA，没有任何潜在的编码蛋白质的能力[33]。lncRNA因其细胞和组织的特异性可以作为癌症的生物标志物和治疗靶点，并且可以在凋亡或坏死肿瘤细胞分泌或释放的血液、血浆和尿液细胞中检测到[34]。越来越多的研究表明，lncRNA在很多癌症中非正常表达，在细胞增殖、凋亡或侵袭都有一定的生物学功能[35-36]。根据最近的蛋白质编码基因，lncRNA可以分为5个不同的类型[37]：①正义链lncRNAs，与相同链的另一个蛋白质编码基因的一个或多个外显子相重叠；②反义型lncRNAs，与相反链的另一个蛋白质编码基因的一个或多个外显子相重叠；③内含子区lncRNAs，来源于次级转录物的内含子区域；④双向lncRNAs，转录起始位点与相反链上编码蛋白质基因的转录起始位点非常接近，但转录方向相反；⑤基因间型lncRNAs，产生于两个基因之间的区域。

越来越多的研究发现lncRNA与冠心病的发生、发展也有很大的联系。lncRNA在诱导炎症反应，血管平滑肌细胞增殖、凋亡，以及脂肪代谢相关方面都发挥重要作用。

2.1细胞增殖、凋亡相关lncRNA与冠心病 在冠心病中lincRNA-p21是一个重要的细胞增殖与凋亡的调节基因，在血管平滑肌细胞中lincRNA-p21能够抑制细胞增殖，引起细胞凋亡[38]。并且lincRNA-p21的G-A-A-G单倍型与冠心病患病风险降低相关[39]。在外周血单核细胞中通过微芯片以及实时荧光定量聚合酶链反应法筛选出3个较好的冠心病lncRNA标志物(CoroMarker、BAT5和IL21R-AS1)，其中CoroMarker在冠心病较其他的心血管疾病中差异表达，特异性和敏感性更好。并且实验证明这个CoroMarker基因能够正向调控泡沫细胞的形成和动脉硬化，抑制细胞凋亡、炎症以及相关免疫反应[40]。H19是一个转录lncRNA的印迹基因并且在出生后表达下调。研究首次证明H19的多态性与中国人冠心病的风险和严重程度有关[41]。同时，也有研究发现，下调H19基因的表达能够促进鼠心肌细胞P19CL6的增殖和抑制细胞凋亡，而这个过程是在心脏分化晚期通过负调控miR-19b来完成的[42]。冠心病患者血浆H19和预测心脏重构的基因间lncRNA、LIPCAR水平显著升高[43]。在508例冠心病患者和562名年龄、性别和种族匹配的健康组中发现，MALAT1中的rs619586AG/GG基因型可预防冠心病的发生。下调MALAT1可抑制血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖，减少心肌细胞凋亡，改善左心室功能，与冠心病等诸多病理过程密切相关[44]。MEG3表达水平在冠心病患者中较健康组下调。过表达MEG3能够抑制miR-21的表达，从而抑制内皮细胞增殖和减少Ⅰ型胶原蛋白，Ⅴ型胶原和蛋白聚糖的表达[45]。

2.2其他与冠心病发生发展相关的lncRNA Fendrr被认为在胚胎期的心脏系统发育中发挥关键作用，并且Fendrr具有组织特异性，是心脏和身体壁发育的调节剂[46]。研究发现在冠状动脉斑块中，FENDRR的表达明显下调[47]。Bvht是一个与鼠心脏相关的lncRNA，是激活多功能心血管前体细胞主调控器MesP1上游核心心血管基因网络和功能的必要条件[48]。在冠心病患者中，LncPPARδ的表达量较正常组增加了2.2倍。下调LncPPARδ的表达会降低过氧化物酶活化受体δ,脂肪分化相关蛋白和血管生成素4的表达[49]。ANRIL的EU741058转录本的表达水平可能与冠心病的发展有关[50]。并且从来自6个独立研究的12 005名受试者中发现，ANRIL等位基因rs4977574与冠心病危险之间存在显著相关性[51]。H19、MIAT、ANRIL、lincRNA-p21、AC100865.1、OTTHUMT00000387022、NONHSAT112178、Novlnc6、MALAT1、LIPCAR和SRA被认为是冠心病的新型调节基因或生物标志物，参与了冠心病病理的起始和进展[52]。

3 环状RNA与冠心病的关系

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种新型的ncRNA，它形成了一个共价闭合的环状结构[53-54]。在整个物种中，大部分的环是高度保守的，并且经常显示出组织或表达特异性，在一些心血管疾病和癌症中通常能检测到异常表达的circRNA[55]。circRNA大多数定位于细胞质中，少数定位于细胞核内。并且大多数由外显子形成，少数来源于内含子或内含子片段[56]。其中，很大一部分的环只产生于一个外显子或多个外显子。circRNA有miRNA海绵的功能，可以调节基因表达或直接调控基因的剪接和转录，同时其也是细胞的潜在调控因子[57]。

3.1细胞增殖、凋亡相关circRNA与冠心病 以表达高糖诱导的血管平滑肌细胞在体外的circRNAs表达谱，circRNAs微阵列分析发现一个上调表达的circWDR77。在体外细胞试验中，circWDR77沉默显著抑制平滑肌细胞的增殖和迁移。生物信息学方法发现miR-124和成纤维细胞生长因子2是circWDR77的下游目标。RNA免疫沉淀和(或)荧光素酶功能验证实验表明，circWDR77通过靶向miR-124/成纤维细胞生长因子2调控血管平滑肌细胞的增殖和迁移，为糖尿病相关性血管病变提供了新的理论依据[58]。人体circRNA微阵列分析显示，在氧化低密度脂蛋白诱导的HUVECs中，hsa_circ_0003575得到明显上调。结果表明，hsa_circ_0003575沉默促进了HUVECs的增殖和血管生成能力。circRNA微阵列分析揭示了HUVECs的表达谱，并验证了hsa_circ_0003575对HUVECs的作用，为动脉粥样硬化血管内皮细胞损伤提供了一种治疗策略[59]。

3.2其他与冠心病发生发展相关的circRNA 也有研究通过微阵列筛选以及后续的分析发现，在冠心病患者中有9种circRNA(hsa_circ_0089378, hsa_circ_0083357, hsa_circ_0082824, hsa_circ_0068942, hsa_circ_0057576, hsa_circ_0054537, hsa_circ_0051172, hsa_circ_0032970, hsa_circ_0006323)能够通过抑制hsa-miR-130a-3p来促进瞬态受体电位阳离子通道亚家族M成员3的表达[60]。在137例冠心病患者中hsa_circ_0124644较115名健康组明显上调[61]。经基因芯片从6名冠心病患者及6例正常对照者中筛选，后经实时荧光定量PCR法从20对临床样本中验证发现外周血hsa-circRNA11783-2与冠状动脉疾病和2型糖尿病相关[62]。

目前对于circRNA与冠心病的相关研究还处于早期研究阶段，对深入机制的研究还未成熟，有待更加深入的发现和探索。

4 小 结

ncRNA在冠心病发生发展及在疾病的诊断和预测方面具有重要价值，并且成为近几年国内外研究的重点之一。miRNA片段较小，在体液中能够稳定检测到，并且能够耐受内源性RNA酶的降解作用。lncRNA具有组织特异性，并且参与细胞内多种生物过程的调控。而最近研究非常广泛的circRNA，具有高度保守性，并且呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶降解，更加稳定。具有以上优势，并且与疾病的发生发展密切相关，使得ncRNA成为新型的生物标志物。同时lncRNA、circRNA与miRNA有着非常密切的联系，lncRNA可以作为一种竞争性内源性RNA与miRNA相互作用，参与靶基因的表达调控。对ncRNA全面的总结也为miRNA、lncRNA、circRNA的通路研究提供更多借鉴意义，随着研究的不断进展和深入，ncRNA有望真正应用于临床，作为冠心病筛查的生物标志物和治疗靶标。