线粒体在细胞衰老中的作用

王玉全，李程程，孟爱民，樊飞跃

(中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心 国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心，北京 100021)

细胞衰老是指细胞在执行生命活动过程中增殖分化能力和生理功能逐渐发生衰退的过程。研究发现众多疾病与细胞衰老有关，如肿瘤、特发性肺纤维化、高血压、帕金森病、糖尿病等[1-4]。因此，细胞衰老机制的研究对于相关疾病致病机制的认识、治疗方法的发现、治疗药物的研发具有重要意义。近年来对于细胞衰老分子机制的研究主要包括氧化自由基学说、DNA损伤积累和端粒缩短等。线粒体作为细胞“能量工厂”，其质量、活性改变与细胞衰老密切相关。线粒体损伤引发的线粒体功能障碍导致活性氧类(reactive oxygen species，ROS)代谢紊乱，过多的ROS具有细胞毒性作用，造成脂质、蛋白质、DNA损伤，激活DNA损伤应答，导致细胞衰老。有研究表明，提高衰老细胞中线粒体自噬水平可以清除损伤的线粒体，降低细胞内ROS，缓解细胞衰老表型[5]。近年来研究发现衰老与干细胞功能的下降密切相关，而线粒体自噬可以有效清除干细胞中功能缺陷的线粒体，维持干细胞功能[6]。由此，线粒体改变可能影响细胞衰老过程，线粒体损伤修复可能是应对细胞衰老有效的靶向策略。现就衰老细胞中线粒体的改变，线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)、ROS、线粒体自噬、线粒体介导的干细胞功能和炎症调节在细胞衰老中的作用进行综述。

1 衰老细胞中线粒体形态、数量改变

正常细胞中线粒体是一个双层膜的囊状小体，由外膜、膜间隙、内膜、基质组成。电镜下观察外膜光滑连续，结构简单；内膜高度折叠成嵴；通常情况下呈短棒状或圆球状，大小0.5～1.0 μm。研究发现，与正常细胞相比，衰老的卵巢细胞中线粒体的结构形态、数量发生了很大变化，主要表现为线粒体体积肿胀增大，线粒体数目减少或增加，线粒体内膜损伤或嵴缩短，线粒体变性导致空泡等[7]。脐静脉内皮细胞的传代培养中发现衰老细胞出现线粒体减少，线粒体肿胀、积水样变[8]。在阿奇霉素所致的大鼠心力衰竭模型中也发现了心肌细胞线粒体结构的损伤改变[9]。对人和啮齿类动物卵巢的研究发现，卵母细胞线粒体数量随年龄的增长而减少，线粒体基质密度下降，线粒体嵴减少，甚至出现空泡和破裂现象[10]。这表明线粒体形态、结构、数量的变化与细胞衰老密切相关。线虫衰老研究发现神经、肠、肌肉组织细胞中线粒体数量逐渐累积，这种线粒体数量稳态改变受到线粒体生成和线粒体自噬相关基因的协同调节，稳态失衡导致功能障碍线粒体的累积，造成细胞功能衰退[11]。但对不同年龄人的骨骼肌细胞线粒体分离研究中并未发现线粒体数目的差异[12]。小鼠和果蝇研究中发现[13],老年果蝇线粒体内膜出现显著的形态改变及功能改变，这种改变是由衰老相关氧化磷酸化系统损伤及线粒体ROS产生导致；然而在小鼠心脏细胞线粒体中无明显的鼠龄改变，1/4肝脏细胞线粒体出现严重衰老相关表型但整体氧化磷酸化水平没有降低，具有明显的组织特异性。随着年龄增长或在衰老的器官组织细胞中会发生线粒体形态、结构、数量的改变，但它们之间确切的因果关系及分子机制还需要进一步研究。

2 mtDNA突变引发细胞衰老

人mtDNA是由16 569个碱基组成的环状DNA分子，没有内含子，D环是唯一的非编码区，调控mtDNA的复制转录。mtDNA主要编码电子传递链复合体蛋白及其相关组分，与线粒体的功能密切相关。mtDNA缺乏组蛋白和内含子，极易发生突变。与衰老有关的mtDNA突变主要有点突变、缺失和重排，mtDNA的点突变和缺失发生频率最高。研究证明mtDNA损伤突变与骨骼肌、心、肝、脑、皮肤等器官的衰老密切相关，衰老的骨骼肌，心肌细胞中检测到mtDNA4977缺失，mtDNA4977突变会干扰细胞中呼吸相关蛋白的合成，导致线粒体功能障碍，导致细胞功能受损而发生衰老[14-15]。同时，心肌细胞中mtDNA突变的累积会导致电子传递链功能组分的合成障碍，从而导致电子传递链功能下降，加剧心肌细胞衰老[16]。mtDNA聚合酶缺陷小鼠模型检测到mtDNA突变累积，表现寿命缩短和过早衰老[17]；加速衰老小鼠易发8(senescence-accelarated mouse prone 8，SAMP8)模型表现与年龄有关的神经退行性变，学习和记忆能力受损，这与其大脑细胞中mtDNA修复能力改变和mtDNA损伤水平有关[18]。综上，mtDNA突变一方面会造成线粒体呼吸相关功能组分的合成障碍和缺失，线粒体呼吸能力的下降，从而引发细胞衰老；另一方面，mtDNA突变可能会造成mtDNA复制、修复障碍，突变mtDNA在线粒体内的积累，加重线粒体损伤，加剧细胞衰老。

3 线粒体ROS参与细胞衰老调节

线粒体是细胞的“能量工厂”和自由基代谢中心，线粒体的主要功能是将高能物质经过三羧酸循环产生的烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷磷酸/黄素腺嘌呤二核苷酸通过电子传递链转化为腺苷三磷酸，为机体细胞供能，调节能量代谢。线粒体作为机体细胞最重要的供能“机器”，线粒体的呼吸能力直接关系心肌和骨骼肌的功能，因此线粒体呼吸能力下降会导致心肌和骨骼肌功能障碍，诱发心肌、骨骼肌细胞衰老[19]。同时，线粒体电子传递链的完整对于维持线粒体正常呼吸功能至关重要，许多动物模型中发现线粒体电子传递链复合体的生物合成直接影响细胞衰老[20-21]。目前研究认为，线粒体损伤及功能障碍引发细胞衰老主要与ROS代谢有关。线粒体呼吸链中电子传递是ROS的主要发生器，ROS对于细胞生存、激发损伤应答、细胞增殖、能量代谢具有重要作用[22]。然而，高水平的ROS对细胞具有毒性，造成细胞脂质、蛋白质、DNA损伤[23]。传统的线粒体自由基损伤理论认为ROS作为线粒体能量代谢的副产物在影响线粒体功能导致细胞衰老上有重要作用。1950年，Harmon首次提出ROS直接调控细胞衰老过程，同时，Linnane和Fleming认为ROS的产生增多导致mtDNA突变，引发细胞衰老[24]。由此可见，线粒体ROS是细胞衰老的重要诱导因素。有研究证实，27-羟基胆固醇通过促进细胞内ROS积累并激活白细胞介素-6/信号转导及转录激活因子3信号通路诱导神经细胞衰老，ROS产生阻断可以缓解27-羟基胆固醇诱导的神经细胞衰老[25]。线粒体ROS稳态的破坏也是诱导细胞衰老的关键因素。在间充质干细胞中，阻止线粒体ROS的积累可以抑制间充质干细胞衰老，酪氨酸蛋白激酶B2受体可以通过调节线粒体乙酰化酶3的表达维持线粒体ROS的稳态，减少间充质干细胞的衰老[26]。研究发现，人和小鼠成纤维细胞中DNA损伤应答能激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1β调节的线粒体生物合成，引起ROS水平增高，加剧细胞衰老[27]。在羟基脲诱导的小鼠成纤维细胞衰老模型中，可以通过调节线粒体乙酰化酶3的表达调节叉头框转录因子O亚族3和超氧化物歧化酶的表达来减少ROS的产生，延迟衰老[28]。因此，线粒体内过多ROS的清除及其稳态的维持可以有效抑制细胞衰老。

4 线粒体自噬减缓细胞衰老

线粒体自噬是一种细胞防御代谢过程，通过自噬途径选择性清除衰老、损伤的线粒体，以促进线粒体更新，维持线粒体功能。这一概念由Lemasters[29]首次提出。细胞衰老中线粒体自噬调节与一般自噬稍有不同，一般的自噬活性根据衰老模型而升高或降低，而在衰老细胞中，线粒体自噬活性在体外和体内均降低[30-31]。在磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1(PTEN induced putative protein kinase 1，PINK1)-PRKN(Parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase)通路介导的线粒体自噬中，Parkin激酶能泛素化线粒体外膜蛋白，这些蛋白一旦被泛素化便可被线粒体自噬受体蛋白视神经蛋白(Optineurin)、核点蛋白52和Tax1结合蛋白1识别，从而激发自噬体的组装，清除损伤线粒体[32]。细胞衰老过程细胞质中积累p53与Parkin相互作用，阻止其转运到功能失调的线粒体，从而抑制线粒体自噬，维持细胞衰老[31]。这进一步提示线粒体自噬在细胞衰老过程中的重要作用。人支气管上皮细胞中PINK1和Parkin的敲除会加速其衰老，同时伴随损伤线粒体累积和ROS产生增加[33]。暴露于香烟的PRKN敲除小鼠中，呼吸道上皮细胞表现出线粒体损伤积累和氧化修饰增加，并伴有细胞衰老的加速，PRKN过表达则可以诱导线粒体自噬，减弱线粒体ROS的产生，减缓细胞衰老[34]。这表明线粒体自噬受损会导致损伤线粒体累积，细胞ROS水平升高，加速细胞衰老。也有研究发现衰老细胞中，PINK1-Parkin介导的线粒体自噬激活能够清除损伤线粒体，消除通常情况下表达的衰老相关表型，进一步揭示线粒体自噬在清除受损线粒体，减缓细胞衰老中的重要作用[35]。线虫衰老研究发现细胞应激下SKN-1转录因子的激活可以通过调节DCT-1的表达调节线粒体自噬和线粒体生物合成，从而清除损伤线粒体，维持线粒体稳态。细胞衰老过程中，这种稳态的失衡会导致损伤线粒体的过度增殖，细胞功能衰退[36]。在糖尿病肾病中，肾小管上皮细胞的早衰主要是由受损线粒体的积累导致的，视神经蛋白调节的线粒体自噬可以保护肾小管上皮细胞抵抗高糖诱导的衰老[37]。由此可见，线粒体自噬能够清除受损线粒体，减缓细胞衰老。

5 线粒体与干细胞衰老

干细胞衰老通常伴随着组织代谢和再生潜能的下降，成年人干细胞功能衰退与线粒体密切相关[38]。在所有组织中，衰老相关线粒体功能的衰退效应对成体干细胞群功能具有重要影响。造血干细胞研究发现，静止期造血干细胞主要通过糖酵解代谢供能来维持较低的氧环境，以减少线粒体ROS产生的毒性作用[39]。同时，有研究表明ROS作为信号分子，一定水平的ROS对造血干细胞增殖分化有调节作用[40]，水平过高对造血干细胞功能具有损伤作用[41-42]。mtDNA突变小鼠研究揭示了线粒体与干细胞功能之间的联系，mtDNA突变鼠存在干细胞缺陷及功能损伤，给予抗氧化剂治疗，干细胞缺陷及功能损伤得到改善[43-44]。这表明，线粒体损伤直接干扰、损伤小鼠干细胞功能，而这种干扰损伤作用很有可能是由线粒体异常引发的ROS代谢异常导致的。线粒体帮助干细胞维持功能的另一种机制主要是通过调节代谢物乙酰辅酶A、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、腺嘌呤核糖核苷酸、S-腺苷甲硫氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸的比率来调节干细胞的自我更新和稳态[45-46]，如老年小鼠给予烟酰胺核苷治疗可以恢复肌肉干细胞活力，烟酰胺核苷也可以阻止肌营养不良小鼠肌肉干细胞衰老，这主要是由于氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)水平的提高诱导线粒体非折叠蛋白效应(UPRmt)和抗增殖蛋白合成的激活，提高了线粒体稳态调节功能[47]。同时，干细胞可以通过一定的机制清除功能缺陷的线粒体，大脑研究发现大脑神经干细胞富集区域线粒体自噬率升高[48]，PINK1基因缺陷小鼠实验也证实线粒体自噬对线粒体质量的控制是干细胞命运至关重要的决定因素[49]，人乳腺干细胞分裂研究发现干细胞样细胞可以通过不对称分裂来隔离年轻和衰老的线粒体，以保持干细胞活性[50]。上述研究为了解线粒体对于干细胞全能性的维持及组织分化修复上提供了新的观点，也为细胞衰老及衰老相关疾病的研究提供了新的指导方向。

6 线粒体调节的炎症反应与衰老

衰老细胞会产生一系列复杂的分泌因子，包括基质金属蛋白酶、生长因子和促炎症细胞因子，统称为衰老相关分泌表型，衰老相关分泌表型可以加重衰老细胞的促衰老效应。衰老相关分泌表型的形成与线粒体密切相关，线粒体损伤调节的机体免疫应答的激活在一定程度上促进炎症细胞因子的分泌。一方面mtDNA类似于细菌DNA，能够通过Toll样受体9、Nod样受体蛋白3炎症小体[51]、受体蛋白干扰素基因刺激物快速激活抗菌免疫应答[52]。同时，损伤的线粒体可以释放甲酰多肽，通过甲酰多肽受体1激起免疫应答[53]。另一方面，采用化学药物抑制线虫线粒体功能，发现短暂的线粒体功能障碍也可以作为病原攻击激活免疫应答[54]，表明线粒体功能异常同样可以激发炎症反应，而这种激发作用很有可能是由于线粒体ROS代谢异常导致的。在对阿尔茨海默病风险因素——环境毒素(百草枯)暴露对哺乳动物认知功能障碍的作用研究中发现线粒体ROS清除可以抑制Nod样受体蛋白3炎症应答的激活，减少大脑炎症反应，缓解认知功能障碍[55]。在SAMP8小鼠神经退行性改变早发的研究中也发现线粒体ROS在炎症激活中的作用，SAMP8小鼠具有较多的线粒体ROS产生，较低的mtDNA修复能力，高水平的氧化应激诱导炎症反应，促进炎症细胞因子释放，同时，mtDNA损伤的增加加剧线粒体功能障碍及细胞功能障碍，最终协同导致SAMP8小鼠神经退行性改变的早发[18]。尽管如此，在细胞衰老过程中，线粒体损伤既可能是炎症的激发剂，也可能是炎症反应的结果，它们均可在一定程度上促进衰老的发生、发展。

7 展 望

线粒体在受到辐射等氧化刺激时会发生mtDNA突变。mtDNA突变一方面会造成线粒体内与电子传递链相关组分的合成障碍和缺失，线粒体功能障碍。线粒体功能障碍导致机体组织细胞的能量代谢障碍，ROS代谢失调，引发细胞衰老。另一方面，mtDNA突变会造成mtDNA复制障碍，造成突变mtDNA在线粒体内的积累，突变的累积可以激活DNA损伤应答，造成细胞周期阻滞及ROS生成增加，高水平的ROS则可作为毒性分子进一步损伤线粒体，加剧细胞衰老甚至导致细胞凋亡。同时，线粒体功能损伤，ROS代谢障碍可以影响干细胞功能调节，造成组织再生、修复障碍、炎症反应的激活。线粒体损伤导致的线粒体蛋白、mtDNA外溢以及线粒体功能受损可以作为损伤相关分子模式激活免疫应答，免疫因子大量表达，进一步损伤机体其他细胞。当然，机体可以通过线粒体自噬等途径来清除损伤、功能障碍的线粒体，以维持机体代谢稳态，延缓细胞衰老。说明线粒体损伤修复、线粒体功能复原及提高线粒体质量控制将是应对细胞衰老的有效策略。随着对衰老机制的深入研究，线粒体在细胞衰老中的作用会更加清楚，大范围的线粒体靶向治疗很可能成为对应对衰老的有效策略，在缓解或治愈衰老相关疾病中发挥重要作用。