2株柴油降解菌的分离筛选及生长特性分析

周宏飞， 陈 玮， 杨鑫星， 辛德东， 巩菊芳， 孙梅好

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

0 引 言

油烃类污染物已被列为环境中应优先控制、潜在危险性大的毒害性污染物，即优先控制污染物(priority pollutants)[1].在油烃类污染物中，柴油是一类烷烃和芳香族化合物的复杂混合物，常通过储罐或管道泄漏造成土壤污染[2].柴油污染土壤后会影响土壤的通透性、微生物的生长及植物根系发育等，致使作物减产[3].

柴油污染土壤的修复方法主要有物理修复、化学修复、微生物修复及植物修复等[3].物理和化学修复法通常存在费用昂贵、造成二次污染及修复范围有限等缺点，而微生物修复具有费用低、环境友好、操作便捷等优点[2-4].微生物修复从原理上可分为生物强化、生物刺激及生物通风3个方面，其中生物强化是指在污染土壤中加入相应降解菌以提高有机物的降解[2].目前，有关降解菌的研究主要包括降解菌的筛选、生长特性分析、生物表面活性剂鉴定及降解机制的研究等.科学家已从污染的空气、土壤、海水中筛选了不同的降解菌，包括细菌、真菌等，并对柴油降解的机理进行了深入探讨[5-6].生物表面活性剂可通过与细胞膜作用增加细胞表面的疏水性，使细胞易获取疏水性物质，还可通过降低油与水的界面张力，增加不溶物的表面积，从而提高油烃的流动性及生物利用度[6]，所以生物表面活性剂可有效提高降解菌的降解效率.因降解菌合成生物表面活性剂受碳源、氮源、培养条件(温度、盐度、pH等)的影响[7]，分析降解菌的生长及降解条件可有效提高菌株油污降解的性能.筛选优异柴油降解菌，并优化其生长、降解条件，能进一步促进微生物修复在柴油污染修复中的应用.

目前，微生物修复主要应用在海洋、油田等大型污染区域，在加油站、汽车修理厂等附近的污染区域未见微生物修复报道.加油站等的油烃类污染物可以横向或纵向地污染周围的土壤，由于受选择性压力的影响，这些土壤中会存在一些高效利用油烃类化合物的菌株.从加油站及修车厂周围的柴油污染土壤样品中筛选出EGY和GY2株柴油降解菌，通过单因素分析优化了培养参数，并设计了EGY在不同柴油浓度下的柴油降解实验及土壤柴油降解实验，结果表明，EGY可高效降解污染土壤中的柴油，为柴油降解菌的实际应用奠定了一定基础.

1 材料与方法

1.1 实验试剂

柴油(0#)购自中石化；酵母提取物、胰蛋白胨、氨苄青霉素均购自赛默飞世尔科技公司；溶菌酶、细菌DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；DNA Marker,10×PCR Loading Buffer,Primes STARTMHS DNA Polymerase,5×Prime STARTMBuffer,dNTP Mixture(2.5 mmol/L),SolutionⅠ购自大连宝生物工程有限公司；细菌基因组通用引物由上海生工生物技术服务有限公司合成；其他常规生化试剂均为购自金华医药有限公司的分析纯试剂.

1.2 培养基

参见文献[8]配置柴油培养基.柴油浓度在液体培养基中为体积比，在土壤中为质量比.牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基均用去离子水配置.

1.3 柴油降解菌的富集和分离

1.3.1 采 样

挖取加油站卸油口附近的土壤、加油站中被柴油污染的土壤、加油站中被柴油污染的沙子、修车厂附近土壤分别装于50 mL灭菌离心管中.

1.3.2 土壤样品预处理

称取3.0 g样品，加入到已灭菌的装有90 mL蒸馏水的250 mL锥形瓶中，浸泡、搅拌，室温下密闭静置24 h，上清液即为菌源.

1.3.3 菌株的富集及分离

从各菌源中各取1 mL加入到100 mL柴油液体培养基中(1%，0#柴油)30 ℃,220 r/min摇床培养24 h.待培养液浑浊后，移取1 mL培养液于装有100 mL新鲜柴油培养基的250 mL锥形瓶中，相同条件下连续富集3次.

将富集培养好的菌悬液以不同梯度进行稀释，并在固体柴油培养基上涂布分离，30 ℃培养12 h，挑取生长状态较好的单菌落在固体柴油培养基中30 ℃培养6 h，相同条件下重复3次，得到分离后的菌株.各菌株在柴油无机培养基中培养24 h后，储存于-80 ℃冰箱中待用.

1.4 柴油降解菌的鉴定

细菌的革兰氏染色法鉴定参照胡勇等[9]的实验方法.细菌基因组DNA提取试剂盒方法提取细菌DNA，利用16S rDNA引物(Eubac 27F,Eubac 1492R)扩增片段，并测序.所得序列利用EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/)进行物种分析，利用MEGA7软件[10]进行系统发育分析，选择邻接法(Neighbor joining)[11]构建系统发育树.系统发育树评估采用Bootstrap法[12]，置信值估算重复次数1 000次(支持率高于50%的在图上显示).进化距离通过Kimura 2参数模型计算[13].

1.5 柴油降解菌的生长环境优化

在柴油无机培养基中，利用单因素分析确定并优化EGY和GY单独生长的最佳条件(温度、pH、含油量、盐度).各菌株进行4组单因素变量实验，每组处理重复5次，培养48 h后离心收集菌体加等量无菌水充分悬浮后，利用分光光度计(CARY 4000，Aglent，USA)进行OD600测定.

1.6 EGY降解油污能力的测定

1.6.1 柴油无机盐培养基接菌

在含有不同柴油浓度的100 mL无机培养基中接种1 mL菌液及1 mL无菌水作为对照组，30 ℃,220 r/min摇床培养24 h后离心，取全部上清用于柴油含量测定，每组重复3次.

1.6.2 土壤接菌

取3个规格一致的花盆编号1—3，每盆中装入400 g灭菌土壤和0.4 g柴油后混匀，在1和2号花盆中接入1%的EGY菌种，1号花盆的土壤环境调至该菌最适盐度，2号花盆不调盐度，均在25 ℃下无菌封闭培养10 d；3号花盆未接菌作为对照组，在25 ℃下未封闭放置进行自然降解.

1.6.3 红外分光光度法测定柴油降解

柴油提取及含量测定方法参照2012年环境保护部颁布的《水质石油类和动植物油类的测定红外分光光度法》.根据方法测定校正系数X，Y，Z和F，根据式(1)计算总油含量，由式(2)计算芳香烃含量.取无机培养基上清用CCl4萃取2次，每次3 mL，得待测样品.土壤实验中，培养期间多次取样，1 g土样用40 mL CCl4萃取3次，得待测样品.利用红外分光光度计(670 FT-IR，NEXUS，USA)测定样品中各组分浓度，并计算降解率.

ρ总油=X·A2 930+Y·A2 960+Z(A3 030-A2 930/F)；

(1)

ρ芳香烃=Z(A3 030-A2 930/F).

(2)

式(1)和式(2)中：ρ为含量(mg/L)；A2 930,A2 960,A3 030对应波长下的吸光值；X,Y,Z对应C-H键的校正系数；F为脂肪烃对芳香烃影响的校正因子.求得结果后通过Student′s t-test求得P值，“*”P<0.05表示统计学上有显著性差异；“**”P<0.01表示统计学上有极显著性差异.

2 结 果

2.1 柴油降解菌的分离筛选及鉴定

样品经富集、分离筛选及纯化后，得到2株以柴油为碳源的柴油降解菌，将其分别命名为EGY和GY.菌株的表面形态观察和革兰氏染色结果表明,EGY为革兰氏阳性菌，菌落为黄色，边缘光滑、不透明，菌斑圆形，表面湿润黏稠；GY为革兰氏阴性菌，菌落为白色，边缘光滑、中央透明，菌斑圆形，表面湿润.通过16S rDNA测序和进化树分析表明，EGY为琼氏不动杆菌(Acinetobacterjunii)(见图1).GY与鞘脂菌属的Sphingobiumlactosutens及Sphingobiumchungbukense在进化树上可以聚为一支，这表明，GY是鞘酯菌的一个新种(见图2).

2.2 菌株生长条件分析

2.2.1 温度对菌生长的影响

温度可以影响营养物质的溶解度、酶活性、细胞膜流动性等,从而影响细胞的生长及物质运输.故探究菌株最适温度有利于优化其降解柴油能力.2种菌株于柴油无机盐培养基(pH 7.0、柴油量为1%)中20，25，30，35和40 ℃下培养，结果表明，EGY和GY生长的最适温度分别为25，35 ℃，且在该范围内二者均有一定的生长能力(见图3).

图1 邻接法构建菌株EGY的16S rRNA基因系统发育树

图2 邻接法构建菌株GY的16S rRNA基因系统发育树

图3 温度对EGY和GY生长的影响

2.2.2 pH对菌生长的影响

pH会使蛋白质和核酸等生物大分子所带电荷及其细胞膜电荷发生变化，对细菌吸收运输柴油具有较大影响，从而影响菌株的生长.2种菌株在最适温度下利用不同pH(5.0，6.0，7.0，8.0和9.0)的柴油无机培养基(柴油量为1%)培养，结果表明，EGY和GY生长最适的pH分别为8.0和7.0，EGY生长偏爱碱性环境，强酸环境不利其生长(见图4).

图4 pH对EGY和GY生长的影响

2.2.3 柴油含量对菌株生长的影响

降油菌在含油量过少的环境中不能获取足够的碳源而影响生长繁殖，而过高也会影响其对氧气和营养物质的利用，影响其正常生长.探究不同柴油浓度下(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%)各菌株生长情况.结果表明,2株菌最适生长含油量为1.5%.在柴油浓度小于1.5%时，随着柴油浓度的增加,菌生长能力增加明显；而大于1.5%时，生长能力有所下降(见图5).

图5 柴油浓度对EGY和GY生长的影响

2.2.4 NaCl浓度对菌株生长的影响

无机盐是细胞、酶的重要组成部分，也为细胞提供合适的渗透压.高浓度无机盐会增加细胞的渗透压，抑制微生物各种代谢酶的活性，降低其降解污染物能力.2种菌株分别利用不同盐度(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g/L)的柴油无机培养基，并在各自的最适温度、pH、含油量条件下培养.结果表明，EGY和GY分别在盐浓度为1.5，2.0 g/L时生长量达到最大(见图6).

图6 NaCl浓度对EGY和GY生长的影响

2.3 菌株降解油污能力分析

通过分析EGY和GY菌株的生长温度、pH、盐浓度等，笔者发现，EGY的最优生长条件最接近于加油站等附近的土壤环境.将此菌株接种至不同柴油浓度的无机培养基中培养后测定降解率，结果表明,在较低柴油浓度下(0.5%),柴油降解率高达40.2%;但当柴油浓度为1.5%，2.5%时，降解率稳定在25%左右，无显著差异.在0.5%，1.5%浓度下，EGY对芳香烃的降解率大于40%，无显著差异;但当浓度为2.5%时，芳香烃降解率显著下降(见图7).为分析EGY对土壤的修复效果，将EGY接种至含1.0%柴油的灭菌土壤中，并分析土壤盐度对降解效果的影响.结果表明,未接EGY的土壤中柴油逐渐被自然降解，10 d时柴油降解率为15.3%；而在最适盐度和未调节盐度下接入EGY后,初始降解速度较快，6 d后降解缓慢，10 d后降解率分别为72.1%，57.8%(见图7).

(A)无机盐培养基中

(B)1.0%柴油土壤中

3 讨论与分析

科学家已从柴油污染样品中筛选了芽孢杆菌、假单胞菌、不动杆菌等[14-16]多种柴油降解菌，但多数降解菌只应用在海洋、油田等大型区域，在加油站或修车厂等附近区域还未应用于实际.研究从加油站等周围的土壤样品中筛选到优异柴油降解菌EGY和GY，并优化其柴油降解条件，将进一步促进微生物修复在柴油污染修复中的应用.在EGY所属的不动杆菌属中，报道的柴油降解菌较多，如Acinetobacterbeijerinckii[17]，Acinetobactercalcoaceticus[18]及AcinetobacterjuniiB6[19]等，暗示EGY可以作为优异的柴油降解菌.GY所属的鞘脂菌属是多环芳香烃污染土壤中的主要菌属[20]，也能以柴油为唯一碳源生长.有研究报道,与GY亲源关系较近的Sphingobiumlactosutens和Sphingobiumchungbukense也能降解环芳香烃[21-22]，因此,后续实验将分析GY降解芳香烃的能力.

在实际应用过程中，适宜的生长条件能有效提高降解菌降解柴油的能力，如营养盐、pH、温度等[23].对于柴油降解菌而言，温度会影响生物表面活性剂的稳定性及细菌对柴油的摄取能力.一些筛选的柴油降解菌的最适降解温度已被确定，如假单胞菌F4为37 ℃[14]，鲍氏不动杆菌为35 ℃[24].EGY和GY最适温度分别为25 ℃和35 ℃，与上述报道降解菌最适温度接近，可应用于加油站、修车厂等附近的土壤修复.pH可显著影响一些表面活性剂的形态与表面张力，从而影响菌株的降解能力[25].因此，GY和EGY在柴油培养基中的pH生长特性可能与其分泌的表面活性剂有关.GY和同属的Sphingobiumsp. FB3[26]及一些降解菌(如假单胞菌[14]、芽孢杆菌[16]等)的最适pH都为中性，而EGY的最适pH为8，适合应用在碱性环境中.EGY和GY最适盐度分别为1.5 g/L和2.0 g/L，显著低于海洋环境中典型的盐度(3.0%～3.5%)，因此,这些菌株不适合应用在海滩或潮间地带.在柴油无机培养基中，2株菌的最适生长含油量为1.5%，而PALANISAMY等[15]筛选的鲍氏不动杆菌最适柴油量为4.0%.2株菌不适合在高浓度柴油下生长，可能是由于过量柴油的加入导致溶液中含氧量低及芳香烃含量增加所致.EGY培养后出现了乳化现象，表明EGY可能通过产生生物表面活性剂降解柴油.许多文献也报道了不动杆菌能通过分泌鼠李糖脂[6]、脂肽类[19]及生物分散剂[18]等，以降低油水表面张力、增加烃类溶解性.此外，Tao等[4]研究发现其筛选的琼氏不动杆菌能够产生生物表面活性剂，但在培养物中未发现糖脂类和肽脂类，说明该类活性剂不属于这2类.因此，为明确EGY降解柴油的机制，后续实验需提取、鉴定及明确该类生物表面活性剂.

为分析EGY的柴油降解能力及实际应用情况，笔者分析了不同柴油浓度对其降解率的影响，以及EGY是否适合于降解土壤中柴油.利用不同柴油浓度培养EGY时，发现低柴油浓度条件下细菌为获取足够的碳源，导致其具有较高的降解率(40.2%)，但其降解量远小于高柴油浓度条件下的降解量，这与生长最适初始柴油浓度为1.5%相符.2.5%初始浓度时，柴油降解量最大但细菌生长情况较差，可能是由于高浓度柴油下，EGY优先选择降解脂肪烃，导致芳香烃的积累影响了细菌生长[27].EGY接入污染土壤10 d后，通过调节土壤盐度，其降解率(72.1%)远高于自然降解率(15.3%)，提高了污染土壤的修复速度.在自然降解中，由于土壤细菌作用及柴油挥发等原因，每天有1.5%的柴油被降解.实验组中，在前6 d具有较大的降解速率可能是由于EGY能够选择并快速降解线性或短链碳氢化合物，而之后需利用一些难以利用的化合物(如芳香族碳氢化合物)并产生具有毒性的中间产物等，限制了降解速率[2].

本研究虽然初步明确了EGY的柴油降解条件和降解性能，但柴油降解菌的降解效率也受到其他多种不同因素的影响，如柴油的性质、不同微生物之间的相互作用、土壤种类等.在后续的研究中将着眼于EGY降解柴油的内在机制，以及其可能分泌的表面活性剂等，进一步优化其降解能力等方面；还可探究EGY与其他微生物优势菌群的相互作用及复配，为将来应用于实际提供理论依据.此外，在实验室控制条件下探讨降解修复性能无法准确、长久地反映实际应用情况[28]，后续将利用真实的污染土壤地块，分析EGY的柴油降解能力，为将来规模化实际应用奠定基础.