表没食子儿茶素没食子酸酯对糖尿病大鼠心脏的保护作用及对TGF-β 1/Smad3信号通路表达的影响

2019-02-27孙敬茹陈克研孙倩韩梅

中国医科大学学报 2019年2期

孙敬茹，陈克研，孙倩，韩梅

（1. 辽宁省金秋医院内分泌科，沈阳 110016； 2. 中国医科大学实验动物部，沈阳 110122）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DC）是糖尿病的一种较常见的并发症，目前已经证明心肌异常和糖尿病之间存在因果关系。据统计，DC约占糖尿病患者的12%，并可能导致心力衰竭和死亡［1-3］。链脲佐菌素（streptozocin，STZ）对胰岛β细胞有细胞毒性作用，短期高糖高脂饮食联合STZ腹腔注射是目前较常用的诱导2型糖尿病动物模型的常用方法［4-6］。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是从绿茶中提取的儿茶素类单体，是茶多酚主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分［7］。因其特殊的化学结构，具有较强的抗氧化能力，目前主要用于抗肿瘤和预防心血管疾病［8］。本研究在建立2型糖尿病大鼠模型的基础上给予EGCG，观察其对糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用，进一步探讨其对TGF-β 1/Smad3信号通路表达的影响，为DC的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级SD大鼠，雄性，体质量200～220 g，由北部战区总医院实验动物科提供，通过实验动物福利伦理审查，动物自由饮食水。采用随机数字表法将动物平均分成4组，分别为假手术组（Sham组）、2型糖尿病心肌病模型组（DC组）、EGCG组［于糖尿病模型建立成功后，腹腔注射EGCG （100 mg/kg） 28 d］和二甲双胍阳性对照组［Met组，于糖尿病模型建立成功后，每天给予大鼠二甲双胍灌胃（140 mg/kg），连续28 d］。

1.2 糖尿病大鼠模型建立

大鼠饲喂高脂饲料8周。用0.1 mmol/L无菌枸橼酸缓冲液配置为6.5 g/ L、pH4.3的STZ溶液，腹腔注射40 mg/kg，72 h后检测血糖，血糖≥16.7 mmol/L认为造模成功。

1.3 样本采集与检测

于给药28 d后用生理记录仪检测各组大鼠心脏功能，收集血液，一部分送检验科检测甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、糖化血红蛋白（blood hemoglobin ALC，HbAlc）和空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），另一部分分离血清用于ELISA检测。另取心脏组织样本，一部分固定于多聚甲醛中，剩余部分于-80 ℃冰箱保存。

1.4 ELISA检测

为观察EGCG对DC氧化应激、心功能的影响，采用ELISA试剂盒（南京建成生物技术有限公司）检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GPX）的含量，具体步骤参照说明书进行：在酶标板上加入标准品，依次倍比稀释；每孔加入血清样本100 μ L，37 ℃温育60 min，洗涤液洗涤5次；每孔加入50 μ L酶标二抗，37 ℃温育30 min；每孔加入显色剂A和B各50 μ L，37 ℃避光显色15 min；每孔加入终止液50 μ L；酶标仪检测450 nm处的吸光度值，绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.5 Masson染色观察心肌组织

甲醛固定组织48 h后，进行脱水、透明、浸蜡后对心肌组织进行石蜡包埋，将包埋好的心肌组织连续切片后，将切片脱蜡至水，用Regaud苏木精染液染色5 min，充分洗涤，盐酸乙醇分化3～5 s，用Masson丽春红酸性复红液染色5 min，以2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷钼酸水溶液分化3 min，光绿液染5 min；以0.2%冰醋酸水溶液浸洗，95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明、中性树胶封固。

1.6 Western blotting检测大鼠心肌组织中转化生长因子 β 1 （transforming growth factor β 1， TGF-β 1）、pSmad3和Smad3表达

将心肌组织置于含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中，于冰上对心肌组织进行匀浆，收集上清液后，使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，对蛋白进行SDS-PAGE电泳、用PVDF膜转膜后，加入TGF-β 1 （ab92486），Smad3 （ab40854），pSmad3（ab52903）抗体，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h后，使用ECL发光试剂盒和凝胶成像系统对蛋白进行显色，结果使用Image Tools进行吸光度分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 EGCG对DC大鼠血糖和血脂的影响

与Sham组相比，DC组大鼠TG、TC、HbA1c和FBG水平显著升高，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；与DC组相比，EGCG组和Met组大鼠TG、TC、HbA1c和FBG水平显著降低，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表1。

2.2 EGCG对DC大鼠心脏功能的影响

表1 各组大鼠TG、TC、HbA1c和FBG水平的变化（s，n = 10）Tab.1 TG，TC，HbA1c，and FBG levels in the rats in each group （s，n = 10）

1） P ＜ 0.05，compared with Sham group； 2） P ＜ 0.05，compared with DC group.

Sham 0.682±0.084 1.712±0.532 25.731±3.224 5.272±1.082 DC 1.374±0.0931） 5.417±0.6721） 39.853±2.8821） 18.531±1.8841）EGCG 0.871±0.0672） 3.212±0.4112） 26.532±1.8312） 6.742±0.9412）Met 0.822±0.0692） 2.182±0.3412） 25.984±2.1122） 7.032±1.1162）

与Sham组相比，DC组大鼠左心室舒张末期压力（left ventricular end dilated pressure，LVEDP）、左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）和左心室内压上升段/下降段最大变化速率（maximal rate of the increase/decrease of left ventricular pressure，±dp/dtmax）的绝对值均显著下降，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；与DC组相比，EGCG组和Met组大鼠LVEDP、LVSP和±dp/dtmax的绝对值均显著升高，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表2。

2.3 EGCG对DC大鼠血清SOD、MDA、CAT和GPX 水平的影响

表2 各组大鼠心功能指标变化s，n = 10）Tab.2 Cardiac function indexes in the rats in each group s，n = 10）

1） P ＜ 0.05，compared with Sham group； 2） P ＜ 0.05，compared with DC group.

Sham 1.573±0.075 19.732±1.231 1 562.342±184.531 1 348.921±219.413 DC 0.652±0.0841） 12.842±1.4411） 785.275±87.9311） 681.937±73.4941）EGCG 1.273±0.0922） 17.617±1.8242） 1 242.280±113.1172） 884.441±88.3232）Met 1.259±0.0772） 17.942±1.6612） 1 318.470±109.8422） 949.821±98.7172）

与Sham组相比，DC组大鼠血清中MDA水平显著升高，而SOD、CAT和GPX水平显著降低，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；与DC组相比，EGCG组和Met组大鼠血清中MDA水平显著降低，而SOD、CAT和GPX水平显著升高，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表3。

2.4 Masson染色

表3 各组大鼠氧化应激因子水平变化 s，n = 10）Tab.3 Oxidative stress factor levels in the rats in each group （s，n = 10）

1） P ＜ 0.05，compared with Sham group； 2） P ＜ 0.05，compared with DC group.

Sham 607.531±27.832 2.131±0.292 658.542±19.231 556.812±12.394 DC 452.440±31.2261） 7.577±0.2311） 251.136±14.6541） 301.180±16.8311）EGCG 533.430±28.9312） 5.127±0.1732） 339.837±16.8342） 388.920±18.9422）Met 554.484±21.0402） 4.994±0.2022） 349.853±10.9312） 406.810±15.3362）

与Sham组相比，DC组大鼠心肌组织见大量胶原沉积，心肌纤维化程度较重；与DC组相比，EGCG组和Met组偶见少量胶原沉积，心肌纤维化程度明显改善，均趋于正常化。见图1。

2.5 Western blotting检测TGF-β 1、pSmad3和Smad3蛋白表达

图1 Masson染色检测各组大鼠心肌组织病理学变化 ×200 Fig.1 Masson staining was used to detect pathological changes in the cardiac muscle tissues of the rats in each group ×200

与Sham组相比，DC组心肌组织中的TGF-β 1、pSmad3表达升高，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；与DC组相比，EGCG组和Met组TGF-β 1、pSmad3蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；EGCG组和Met组TGF-β 1、pSmad3蛋白表达相近，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）；各组Smad3表达差异均无统计学意义（P ＞ 0.05），见图2。

图2 Western blotting法检测心肌组织中TGF-β 1、pSmad3和Smad3蛋白表达水平Fig.2 Western blotting analysis of the expression levels of TGF-β 1，p-Smad3，and Smad3 proteins in rat cardiac muscle tissues

3 讨论

研究［9］表明，高脂饮食合并STZ诱导的糖尿病大鼠会出现严重的心肌损伤，主要表现为心脏功能障碍、心肌氧化应激增加以及心肌纤维化。本研究利用Masson染色、ELISA和Western blotting等技术观察EGCG对大鼠心脏组织、血糖、血脂、心功能、氧化应激因子及TGF-β 1/Smad3通路蛋白表达的影响。结果提示，EGCG可以减轻糖尿病导致的心肌损伤，其机制可能与TGF-β 1/Smad3信号通路有关。糖尿病可以引起严重的心功能损伤，甚至导致心力衰竭和死亡。积极预防DC的发生发展一直都是急需解决的重点和难点。本研究为DC提供了实验理论依据。

糖尿病是一种胰岛素分泌绝对或相对不足的代谢性疾病，常常表现为以高血糖为典型特征的代谢紊乱，并伴随心脏、脑、肾脏等严重并发症，其中心血管并发症已经成为糖尿病主要死亡原因，其临床主要表现为心脏舒张和收缩功能障碍以及心肌结构的改变［10］。有研究［11］表明，DC患者体内氧化应激明显增强，是导致心肌收缩和舒张功能障碍的主要因素。本研究发现，模型建立后，大鼠出现严重的血脂异常和高血糖现象，心脏收缩和舒张障碍，心肌结构损伤严重，大鼠心脏和血清中氧化应激产物MDA含量明显增高，而抗氧化应激酶SOD、CAT和GPX显著降低。提示糖尿病可导致严重的心肌损伤和代谢紊乱，其可能与大鼠体内氧化应激增强有关。

EGCG是从绿茶中提取的一种主要的生物活性多酚，已被发现具有强效的抗氧化剂和自由基清除特性。 EGCG对心血管功能具有多种有益作用，包括减少心肌损伤，减轻体外和体内缺血后心肌功能障碍。张妍淞等［12］研究发现，EGCG对阿霉素引起的心血管损伤具有显著的保护作用，其保护作用与降低心肌细胞凋亡，提高抗氧化防御和保护线粒体有关。本研究建立DC大鼠模型，予EGCG干预，发现EGCG可以缓解糖尿病导致的代谢紊乱，对心脏功能结构具有保护作用，能够抑制氧化应激反应。其对糖尿病大鼠心肌的保护作用可能与抑制氧化应激有关。

TGF-β作为调节细胞分化和生长的TGF-β超家族的成员，主要作用为促进成纤维细胞、成骨细胞和雪旺氏细胞的生长［13］。Smad3是TGF-β 1/ Smad3信号通路激活的标志，已有研究［14］证实，TGF-β 1/Smad3信号通路途径可调节糖尿病大鼠的氧化应激水平。KO等［15］的研究表明，EGCG能改善慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺损伤，其作用机制与调控肺TGF-β /Smad3水平、抑制氧化应激和炎症反应有关。本研究建立2型糖尿病心肌病模型，心肌组织中TGF-β 1、Smad3表达升高，经EGCG干预后，TGF-β 1、Smad3蛋白表达显著降低。提示糖尿病所导致的心肌损伤可能与促进TGF-β 1、Smad3表达，增强氧化应激有关，而EGCG可以通过TGF-β 1/Smad3信号通路途径介导氧化应激来保护糖尿病大鼠心肌损伤。