丹参饮预处理对心肌缺血/再灌注损伤大鼠的心肌保护作用研究

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急性心肌梗死是危害生命安全的危重急症，治疗的关键在于及时、有效地恢复缺血心肌的血液再灌注，如及时地进行溶栓、经皮冠状动脉内成形术(PCI)、冠状动脉旁路移植术(CABG)等再灌注治疗，然而心肌缺血一定时间后再恢复血流供应，常常会引起缺血心肌细胞损害加重的现象，造成心肌细胞凋亡和坏死的加重，即心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)[1]。如何避免或减轻MIRI已成为临床上治疗急性心肌梗死、恢复心肌血供过程中亟须解决的一大难题。本研究拟观察具有活血化瘀、行气止痛的中药复方丹参饮预处理对MIRI的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级，健康雄性成年Wistar大鼠60只，体重180～200 g，饲养于上海中医药大学动物中心，动物许可证号码：SCXX(沪)：2012-0002。

1.2 药物制备 丹参饮：由丹参、砂仁、檀香组成，药材按比例由上海中医药大学附属曙光医院制剂室购置，经浸泡、煎煮、去渣，浓缩药液浓度至1 g/mL(含生药)，保存备用。环孢菌素A购自碧云天(S1563)。

1.3 动物分组及给药 将60只雄性Wistar大鼠随机分成空白对照组、缺血/再灌注(I/R)模型组、环孢菌素预处理I/R组、丹参饮预处理I/R组，每组15只。按大鼠和人的换算量，灌胃给予对应药物，空白对照组、I/R模型组给予蒸馏水10 mL/kg灌胃，环孢菌素预处理I/R组给予环孢菌素A 10 mg/(kg·d)，丹参饮预处理I/R组给予丹参饮生药剂量4.2 g/(kg·d)灌胃，每日灌药1次，持续1周，最后1次用药后1 h行心肌I/R实验。

1.4 大鼠心肌I/R模型制作方法 参考文献[2]，Wistar大鼠使用苯巴比妥腹腔注射麻醉，气管插管，小动物呼吸机辅助通气，用银针探头接大鼠四肢，连接心电图机，记录心电图。剔除其左侧胸部毛，75%乙醇消毒手术区，经第3～4肋间横行剪开胸部皮肤、胸大肌、前锯肌及肋间肌肉，暴露大鼠心脏，将大鼠改为右侧卧位。钝性剥开心包膜及胸腺，暴露左心耳及左心室，用8-0无损伤线于左心耳下缘下2 mm进针，右1/3处出针，结扎左前降支。结扎左前降支时将一纱布网垫置于结扎处，避免损伤血管，心电图显示ST段抬高，结扎心肌变白即为成功，结扎30 min后将丝线结松开，再灌注120 min后结束实验。空白对照组大鼠行开胸及心脏穿线，但不打结。实验结束后，快速摘取心脏，用于各项指标检测。

1.5 心肌梗死面积检测 采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法检测。I/R实验结束后开胸，迅速取下心脏，用预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)漂洗干净。主动脉逆向插管，预冷的PBS冲洗心脏至无血液为止，然后经主动脉注入TTC，37 ℃孵育半小时后，坏死心肌呈现白色，非坏死心肌呈红色，-80 ℃冷冻10 min后，切成1.0 mm厚的薄片，10%甲醛溶液固定过夜。佳能数码相机拍照，使用Image J软件计算左室心肌坏死面积(IA白色区)和左室危险区(AAR：红色区)。心肌梗死面积使用IA/AAR百分比表示。

1.6 线粒体超微结构的观察 实验结束后，立即摘取心脏，PBS清洗干净后，切成1～2 cm3的心肌组织块，放入2.5%戊二醛固定，漂洗，锇酸固定，再漂洗，乙醇脱水，包埋，切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色后，使用透射电镜(TEM)观察线粒体超微结构。

1.7 线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放程度测定 利用观察Ca2+诱导的线粒体肿胀程度法测定线粒体膜通透性转换孔开放的情况，大鼠心肌缺血再灌注结束后，取左室心尖部心肌，线粒体提取成功后，立即按照纯化线粒体膜通道比色法检测试剂盒(购自上海一基实业有限公司)测定。移取20 μL线粒体样品到96孔板对应孔里，加入170 μL室温预热的缓冲液，混匀，室温静置1 min，记录初始读数InitialA440，即刻加入CaCl2诱导剂作用于线粒体，采用酶标仪每隔30 s连续测定30 min内A440 吸光度的变化，计算吸光值比值(A440/InitialA440)的动态变化。

2 结 果

2.1 心肌缺血和再灌注时心电图的表现 大鼠左前降支结扎后心电图显示：ST段弓背向上抬高，前降支复流再灌注2 h后心电图ST段回落。详见图1。

图1 缺血/再灌注时心电图的表现

2.2 丹参饮预处理对于I/R大鼠心肌梗死面积的影响 丹参饮预处理I/R组心肌梗死面积为(28±4)%，环孢菌素预处理组的心肌梗死面积为(25±7)%，I/R模型组大鼠心肌梗死面积为(44±3)%。与I/R模型组比较，丹参饮预处理I/R组、环孢菌素预处理I/R组心肌梗死面积均缩小，差异均有统计学意义(P<0.05)，而丹参饮预处理I/R组和环孢菌素预处理I/R组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2。

与I/R模型组比较，*P<0.05

图2各组心肌梗死面积比较

2.3 丹参饮预处理对于I/R大鼠心肌的线粒体超微结构的影响 电镜下观察线粒体超微结构，空白对照组为正常线粒体，可见完整的线粒体内外膜、清晰的线粒体嵴结构以及致密的基质结构；I/R模型组可见线粒体明显肿胀，线粒体嵴部分断裂，而丹参饮预处理I/R组、环孢菌素预处理I/R组线粒体超微结构较I/R模型组明显好转，线粒体肿胀较I/R模型组减轻。详见图3。

图3 各组大鼠心肌线粒体超微结构(20 000×)

2.4 丹参饮预处理对I/R大鼠心肌线粒体mPTP的影响 在线粒体混悬液中加入CaCl2后，I/R模型组较空白对照组的心肌线粒体肿胀，吸光度下降迅速(P<0.05)，说明mPTP开放迅速；与I/R模型组相比，环孢菌素预处理I/R组和丹参饮预处理I/R组心肌线粒体的吸光度下降幅度均有明显改善(P<0.05)，但丹参饮预处理I/R组与环孢菌素预处理I/R组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见图4。

与空白对照组比较，*P<0.05；与I/R模型组比较，#P<0.05

3 讨 论

《中国心血管病报告2013》显示：我国目前约有250万心肌梗死病人；每年约有29.52万人次因急性心肌梗死住院，随着我国人口老龄化，个人饮食问题等危险因素的增多，心肌梗死发生率呈逐渐增高的趋势，已经成为危害人民健康的重大公共卫生问题。长时间急性冠状动脉闭塞导致心肌梗死，尽管及时开通闭塞的冠状动脉可以挽救缺血的心肌，但是再灌注可以导致梗死面积和细胞凋亡的增加，这一现象称为再灌注损伤[3]。现应对MIRI的方法主要包括缺血预适应(IPC)和缺血后适应(POC)，但临床应用IPC或POC均涉及创伤性操作，显著增加机械性破坏血管床的风险[4]。药物预处理是指用药物模拟缺血预适应中的保护因素而产生预适应效应。目前尚无令人满意的专门用于预防MIRI的药物，一些药物还处于动物实验阶段[5-6]。

心肌梗死属于中医学“胸痹心痛”“真心痛”的范畴，古有“朝发夕死，夕发朝死”的记载，属于心脏科危重急症之一。中医学认为，心肌梗死是由于多种因素，导致心脉痹阻，冠状动脉阻塞，气血运行不畅，造成心肌缺血坏死；当溶栓或者冠状动脉介入血管再通时，微小血栓、细小的粥样硬化斑块等随着开通血管的血流阻塞远端冠状动脉血管，致再灌注后的冠状动脉微血管循环障碍，类似于中医的瘀血内结，络气运行受阻，心络瘀塞，造成MIRI[7-8]；另外，在心肌梗死再灌注复流初期，冠状动脉血流速度突然加快易致水液潴留，在心肌细胞内形成类似“血瘀”的表现，进而导致血管内血流变缓，甚至造成无灌注现象[9]，导致MIRI，因此可以认为“瘀血”贯穿MIRI始终。

丹参饮是用于治疗冠心病-胸痹心痛心血瘀阻证的经典方剂，源自清代的《时方歌括》，由丹参、砂仁、檀香组成，具有活血化瘀的功效。方中丹参味苦，性微寒，入心、肝经，具有活血、行气、止痛的功效。古有“一味丹参，功同四物”的说法：补血生血，功过归地；调血敛血，力堪芍药；逐瘀生新，性倍川芎。砂仁、檀香作为佐使药物温中行气止痛，与丹参共奏活血化瘀、行气止痛之效。此三味，药性味平和，气血双调，重在化瘀，使瘀化畅则痛自止[10]。丹参饮的功效、主治与MIRI的主要治疗原则正好相符。所以本研究预观察丹参饮对MIRI的影响。

本研究采用大鼠前降支结扎复流的MIRI模型，I/R模型组显示心肌梗死范围为(44±3)%，使用丹参饮预处理1周的I/R大鼠，心肌梗死面积为(28±4)%，较I/R模型组明显缩小(P<0.05)，说明丹参饮预处理可以缩小心肌缺血再灌注损伤的心肌梗死面积，具有心肌保护作用。

目前现代医学对于MIRI的病理机制尚不完全明确。近年来，心肌细胞线粒体结构和功能障碍在MIRI病理机制中所起的重要作用引起了大家的关注。越来越多的证据显示：mPTP的开放是I/R时引起线粒体功能障碍，导致心肌细胞坏死或凋亡的关键因素。mPTP在心肌缺血阶段保持关闭，而在再灌注早期，心肌细胞内活性氧聚集，细胞内钙超载，氧化应激等使mPTP开放，引起线粒体结构和功能受损，并释放细胞色素C，消耗三磷酸腺苷(ATP)，触发细胞凋亡信号通路的级联反应，致使心肌细胞凋亡和心肌坏死[11]。有研究显示：I/R早期mPTP开放决定了最终梗死面积的50%，是MIRI的关键[12]。因此，在I/R早期，使用药物性拮抗剂或者基因消融抑制线粒体mPTP开放可以有效地预防MIRI，减少心肌梗死范围[13]。

本研究发现：透射电镜下观察，与空白对照组相比，I/R模型组大鼠心肌线粒体肿胀，而环孢菌素预处理I/R组和丹参饮预处理I/R组大鼠线粒体肿胀较I/R模型组减轻。大鼠心肌线粒体在Ca2+的诱导下，空白对照组线粒体的吸光度值下降迟缓，而I/R模型组线粒体吸光度值下降迅速，而丹参饮与mPTP抑制剂环孢菌素具有延缓其吸光度值下降的作用。说明丹参饮具有减少I/R心肌线粒体肿胀，抑制mPTP开放的作用。

行气活血中药复方丹参饮具有改善心肌缺血/再灌注损伤的作用，其作用机制可能与抑制心肌mPTP开放，减少心肌线粒体肿胀相关。