硫化氢参与疼痛调节作用的研究进展

代韵柯，秦榜勇

(遵义医学院附属医院疼痛科，贵州 遵义 563003)

国际疼痛学会对疼痛的定义是与实际的或潜在的组织损伤相关的一种不愉快的感觉和情感经历。疼痛是临床上最常见的病症之一，极大地危害着人们的身心健康，而阐明疼痛的机制是解决疼痛的基础。硫化氢被列为继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种气体信号分子，有着广泛的病理生理学效应，如舒张血管平滑肌，调节突触活动，诱导海马长时程电位，参与炎症、细胞凋亡等，同时也参与了痛觉的调制作用。研究表明，硫化氢能够调节内脏性、躯体性、神经病理性以及癌性疼痛等临床上常见的疼痛。硫化氢的细胞和分子效应包括激活离子通道、调节第二信使(环腺苷酸、环鸟苷酸、游离钙)水平和蛋白质硫化等[1]。离子通道是第一个被认为是硫化氢靶标的细胞蛋白家族[2]，之后关于硫化氢调节离子通道的报道迅速增加[3-4]。硫化氢对疼痛的调节并不限定于任何特定种类的离子通道(如电压或配体门控通道)，其具体机制尚未完全阐明。现对硫化氢的生理特性、在不同类型疼痛中的作用及其与离子通道的关系进行综述。

1 硫化氢的生理特性

硫化氢是一种无色有毒的具有臭鸡蛋气味的气体，生理状态下主要以HS-形式存在，其次为游离的硫化氢(比例大致为3∶1)。与一氧化氮和一氧化碳相似，硫化氢具有良好的脂溶性，在没有特定转运蛋白时可以快速穿过细胞膜[5]。由单个细胞产生的内源性硫化氢的作用范围可以超过200个相邻细胞。硫化氢的生理分子机制主要是通过与各种氧化剂物质直接反应[6]，或通过增加细胞谷胱甘肽水平[7]，或通过刺激细胞内各种抗氧化剂“主开关”(例如Nrf2)[8]等来发挥抗氧化作用。而关于硫化氢的生理浓度，一直是争论的焦点，目前认为它在哺乳动物细胞及组织中以低微摩尔级浓度存在[9]。

硫化氢以L-半胱氨酸为底物，通过胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthetase,CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)以及3-巯基丙酮酸转硫酶联合半胱氨酸氨基转移酶催化生成。其中，CBS和CSE是硫化氢的主要合成酶，CBS在中枢神经系统中占优势，在脑、脊髓及背根神经节中含量丰富，而CSE主要在心血管系统及外周组织表达，是外周组织硫化氢的主要来源[10-11]。

硫氢化钠是生物学实验最常用的硫化氢供体，可以迅速解离后生成硫化氢。抑制硫化氢合成酶可以减少内源性硫化氢的产生，氨基氧乙酸(aminooxyacetic acid，AOAA)是CBS最常见的抑制剂。虽然AOAA对CBS的抑制为非特异性的，但由于抑制作用强大且目前尚未发现较之更好的替代物，故大量用于在体及离体实验中[9]。CSE最常用的抑制剂包括DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PAG)和b-氰基-L-丙氨酸[12]。另外，也可以运用特异性的反义核苷酸敲除相关基因，以达到使相应蛋白沉默表达的目的。

2 硫化氢在不同类型疼痛中的作用

2.1内脏性疼痛 内脏性疼痛为深部痛，一般定位不准确，是临床上一种常见而难治的疼痛。在膀胱疼痛小鼠中，由CSE和CBS产生的内源性硫化氢引起巨噬细胞移动抑制因子介导的痛觉过敏[13]，表明了内源性硫化氢在内脏痛中的正向调节作用。硫化氢能够在初级感觉神经元中引起内脏痛觉过敏，但其在中枢神经系统中的作用还有待进一步研究。最近有研究发现，结肠炎症模型的新生大鼠脊髓背角胶质细胞的谷氨酸能突触活动频率明显增强，而鞘内注射AOAA能显著减少其突触活动频率，并减轻结肠炎症诱发的内脏超敏反应，硫化氢可能通过脊髓背角神经胶质的突触前机制调节疼痛信号[14]。而大鼠弓状核中CBS的上调可能在慢性胰腺炎的疼痛超敏反应中起重要作用[15]。但是硫化氢既能促伤害，又能抗伤害，它对内脏伤害性感受的影响仍难以确定。比如，硫化氢通过一氧化氮合酶依赖性机制下调小鼠结肠传入的敏感性，减轻由结肠扩张所引起的痛觉过敏反应，说明硫化氢在内脏痛中也具有抗伤害作用[16]。

2.2躯体性疼痛 躯体性疼痛的部位在躯体浅部，多为局部性，疼痛剧烈、定位清楚。文献报道，皮下注射AOAA能够减轻完全弗氏佐剂诱导颞下颌关节炎所致的口面部疼痛[17]。Santos等[18]发现，局部或全身运用PAG可显著减少这种口面部疼痛，而局部注射对减轻伤害性反应更为有效。此外，局部PAG给药引起毛细血管通透性降低，从而使颞下颌血管血浆外渗减少。另外有研究发现，硫化氢可以促进与偏头痛有关的三叉神经节神经纤维的伤害性放电过程[19]。以上研究结果均表明硫化氢参与躯体性疼痛的发生。

2.3神经病理性疼痛 神经病理性疼痛由躯体感觉系统损伤或疾病引起，主要表现为自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉异常。神经病理性疼痛病情重、病程长，给患者身心上造成了极大痛苦。研究显示，在坐骨神经慢性缩窄性损伤所致的神经病理性疼痛模型中，L4～6脊髓CBS的表达及硫化氢的合成增加，疼痛阈值减小，腹腔内给予AOAA能显著逆转坐骨神经慢性缩窄性损伤所引起的痛觉过敏[20]，所以CBS-硫化氢信号有望成为治疗神经病理性疼痛的一个靶点。而在大鼠腰椎间盘突出模型中，鞘内给予AOAA可显著降低背根神经节神经元的兴奋性，并减轻疼痛[21]。另外，也有研究发现外源性硫化氢对神经病理性疼痛具有缓解作用。比如，异硫氰酸酯(缓释硫化氢的供体)通过释放硫化氢减轻紫杉醇或奥沙利铂诱导的神经病理性疼痛[22]。有研究报道，坐骨神经慢性缩窄性损伤模型小鼠连续7 d、8 h/d吸入硫化氢与空气的混合物，其机械痛与热痛阈值增加，同时脊髓小胶质细胞的激活被抑制，表明吸入的硫化氢可能通过抑制脊髓小胶质细胞的活化来阻止小鼠神经病理性疼痛的发展[23]。这些研究有助于进一步理解内源性和外源性硫化氢在神经病理性疼痛作用之间的差异。

2.4癌性疼痛 癌性疼痛由肿瘤压迫、浸润周围器官、神经引起，而慢性癌痛中最常见的就是骨癌痛。研究报道，骨癌痛患者的血清硫化氢水平与疼痛评分呈负相关，而在骨癌痛大鼠模型中，硫化氢预处理(即吸入硫化氢)显著减少骨癌痛，表现为热痛觉过敏和机械性异常疼痛减轻，其机制可能涉及脊髓小胶质细胞失活和炎症抑制[24]。

3 硫化氢与痛觉相关离子通道

3.1硫化氢与Cav3.2通道 低电压激活型的钙离子通道，即T型钙离子通道，生理条件下可在静息膜电位被激活。T型钙离子通道在背根神经节和脊髓后角两级神经元中均有表达，在中枢和外周神经元的兴奋性中起关键作用。目前已经克隆出3个T型钙离子通道的编码基因，分别是Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3。硫化氢特异性地调节Cav3.2通道从而参与对疼痛的调制作用，而Cav3.1和Cav3.3通道对硫化氢不敏感，这可能与Cav3.2通道具有高度的氧化还原性及金属敏感性有关[25-26]。

Cav3.2通道的表达与疼痛状态关系密切，鞘内注射Cav3.2反义核苷酸可以产生强烈的抗伤害性感受的作用[27]。在大鼠足底内和结肠内使用硫化氢供体硫氢化钠，分别引起躯体和内脏的痛觉过敏，其制痛作用可被T型钙离子通道阻断剂或Cav3.2的基因沉默所逆转[28-29]。由环磷酰胺或P物质诱导的小鼠膀胱疼痛模型中，CSE蛋白在膀胱中显著增加，CSE抑制剂、T型钙离子通道阻滞剂或者鞘内注射Cav3.2靶向反义寡聚脱氧核苷酸能显著抑制小鼠的痛觉过敏[30-31]。总体而言，在疼痛中硫化氢对Cav3.2通道似乎是正向调节的。而Elies等[32]认为，在Cav3.2转染的HEK293细胞或随机选择的大鼠背根神经节细胞中，低浓度和高浓度硫氢化钠分别抑制和增强25%～30%的T型钙离子电流。也就是说，硫化氢对Cav3.2的作用并不完全是正向调节的，而有可能与硫化氢的浓度有关。

硫化氢通过Cav3.2通道介导疼痛的机制还未明确。Cav3.2结构域Ⅰ第二个胞外环中第191位的组氨酸残基(His191)对氧化还原剂高度敏感，同时也是Zn2+敏感的结合位点。对Zn2+/氧化还原敏感的His191对硫化氢影响Cav3.2通道似乎起了至关重要的作用[33]，因此，Zn2+水平对Cav3.2通道的活性及硫化氢的调节产生很大影响[34]。但目前仍然很难了解硫化氢是如何通过对Cav3.2通道的作用来介导疼痛的。

3.2硫化氢与Nav1.7通道 电压门控钠离子通道Nav1.7是对河豚毒敏感的、缓慢激活和失活的电压门控钠通道异构体，由SCN9SA编码，主要在背根神经节的感觉神经元中表达，在伤害感受中起关键作用。Yan等[21]证实背根神经节神经元中的电压门控钠离子通道在腰椎间盘突出的大鼠模型中被致敏，鞘内注射AOAA显著减轻大鼠的疼痛超敏反应，同时还降低神经元的兴奋性，抑制Nav1.7通道的钠电流密度及表达。最近有研究报道，产前应激在母体大鼠中增加了CBS和Nav1.7在mRNA和蛋白水平上的表达，腹腔注射AOAA可减弱应激所诱发的内脏疼痛超敏反应，逆转结肠特异性背根神经节神经元的兴奋性，同时降低Nav1.7的表达[35]。但有观点认为，Nav1.7通道在内脏疼痛信号转导中不是必需的[36]。Nav1.7通道可能是硫化氢介导疼痛的又一电压门控离子通道靶点，值得注意的是，其他亚型的电压门控钠离子通道也可能受硫化氢的调控信号的影响，这需要进一步探索。

3.3硫化氢与瞬时受体电位锚蛋白1(transient receptor potential ankyrin-1，TRPA1)/瞬时受体电位香草素1(transient receptor potential vanilloid-1，TRPV1)受体 瞬时感受器电位是一个基因超家族，目前在哺乳动物体内克隆的已有30多个成员，多编码6次跨膜的非选择性阳离子通道，是介导炎性痛、神经病理性疼痛的关键分子。TRPA1是此家族中的重要成员，在无髓鞘的伤害性感受器的亚群中大量表达。Miyamoto等[37]报道，硫氢化钠诱发的背根神经节神经元中钙离子浓度增加受TRPA1受体拮抗剂的抑制。而通过TRPA1受体激活辣椒素敏感的感觉神经，参与硫化氢诱发的皮肤血管舒张的作用[38]。硫化氢对TRPA1受体的调节可能位于TRPA1受体N端胞内结构域中的两个半胱氨酸残基[39]。因此，通过促进TRPA1受体的功能，硫化氢似乎作为伤害性信使起作用。TRPV1在背根神经节和三叉神经节的小型神经元中高度表达。研究显示，新生大鼠结肠炎症诱导的肠易激综合征模型中，去甲肾上腺素的血液浓度增加，结肠相关背根神经节中TRPV1受体和CBS的表达上调。蛋白质印迹、膜片钳和钙成像研究发现，肾上腺素能信号通过CBS-硫化氢信号使TRPV1受体敏化，而参与新生大鼠结肠炎症诱导的内脏超敏反应[40]。

Koroleva等[19]运用膜片钳和钙成像技术，发现分离的三叉神经节神经元中，硫氢化钠瞬时增加辣椒素诱导电流的幅度，而这种作用可被TRPA1和TRPV1受体拮抗剂所抑制，认为在神经炎性条件下，硫化氢激活TRPA1和TRPV1受体，增强了偏头痛初级传入神经的伤害性刺激。许多研究表明，一些TRPV1受体阳性神经元同时表达TRPA1受体，其活性受TRPV1受体调控。而另外有报道指出，TRPA1受体可能调节初级神经元中TRPV1受体介导的电流反应[41]。大量证据表明，TRPA1受体和TRPV1受体介导了硫化氢诱导的伤害感受器的兴奋，参与疼痛过程，但其具体机制还不清楚。值得注意的是，硫化氢可以被氧化成多硫化物，而多硫化物作为一种信号分子，可以调节离子通道，转录因子和蛋白激酶。Hatakeyama等[42]曾提出，多硫化物通过激活感觉神经元中的TRPA1受体而作为伤害感受性物质起作用。而最近的观点认为，由硫化氢和一氧化氮相互作用产生的多硫化物可激活TRPA1受体[43]。这些发现给硫化氢调节TRPA1受体和TRPV1受体介导疼痛的机制研究提供了一些思路。

3.4硫化氢与其他离子通道 N-甲基-D-天冬氨酸受体是第一个被发现的硫化氢靶标的离子通道受体[2]，研究发现，外周注射硫化氢供体，可通过增加脊髓中N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位B的表达引起痛觉过敏[44]。另外，Wang等[45]发现，在大鼠腰椎间盘突出模型中，CBS上调P2X3受体的表达，参与大鼠持续性的痛觉过敏，鞘内给予CBS抑制剂能减轻大鼠痛觉过敏，减少P2X3受体的表达及抑制ATP诱导的细胞内钙信号反应。由此看出，硫化氢对多种痛觉相关离子通道均有调节作用。

4 小 结

硫化氢作为一种新型神经调质，在疼痛的发生发展中有重要作用。迄今为止，硫化氢的具体生理浓度是未知的，且目前还没有很好的方法在细胞内室和细胞外室实时测量硫化氢的浓度，这是研究硫化氢的主要挑战之一。硫化氢在痛觉调制中起重要作用，但其在疼痛中的发病机制和治疗中的作用还需进一步探索。根据目前的研究，内源性和外源性硫化氢在疼痛发生发展中的作用存在差异，研究者普遍认为，内源性硫化氢在疼痛中起正向调节作用，而对于外源性硫化氢却意见不一，且存在完全相反的结论，这可能与给药方式、给药浓度及实验环境等各种因素有关，但其具体原因还不清楚。硫化氢调节多种离子通道，参与疼痛的发生发展，但硫化氢调节各个离子通道的具体机制还未完全阐明，而作为硫化氢靶标的离子通道之间是否存在相互作用，也有待进一步研究。随着对硫化氢疼痛调节作用研究的深入，有可能发现硫化氢在临床疼痛治疗中的应用价值，提供新型的治疗策略，给疼痛患者带来希望。