长链非编码RNA在肝癌侵袭转移中的研究进展

蒋志俊，陈 洁综述，黎乐群审校

0 引 言

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）简称肝癌，在恶性肿瘤中发病率占第6位，是世界上最常见的恶性肿瘤之一［1］。国家癌症中心最新公布的数据显示，2014年肝癌发病率约为26.67/10万，居全国癌症排行第4位，死亡病例约31.9万，死亡率仅次于肺癌［2］。2017年中国肝癌诊疗规范扩大了肝癌切除适应症，认为肝切除手术治疗是保证肝癌患者长期生存的重要方法，可以明显改善患者的预后生存质量［3］。但术后肝癌的复发转移率仍高居不下，严重影响了肝癌总体治疗水平的提高。随着医疗技术与手段的不断提高，我们对肝癌复发转移机制已有深入研究，但临床肝癌复发转移问题远未解决，肝癌侵袭转移的确切机制仍需进一步探索。因此，积极开展肝癌侵袭转移的研究，对于探索新的肝癌干预靶点具有十分重要的意义。目前LncRNA为肿瘤领域的研究热点，研究表明其在原发性肝癌发展和侵袭转移的过程中发挥着不可替代的作用，有望为肝癌的防治提供新的思路。文章就近5年来对LncRNA相关基因与原发性肝癌侵袭转移关系的研究作一简要综述。

1 LncRNA概述

在人类基因组中，参与编码蛋白质的基因仅占2%，超过98%基因组不编码蛋白质，其基因转录产物被称为非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）。根据其长度，可将ncRNA分为miRNA、snoRNA、piRNA和LncRNA［4］。ncRNA中大多数为LncRNA，LncRNA的基因长度往往大于200bp，其开放阅读框一般短于50～100bp［5］。根据LncRNA在基因组中与编码蛋白质基因的相对位置，可将其分成5类，即反义LncRNA、正义LncRNA、双向LncRNA、基因内LncRNA 和基因间 LncRNA［4］。

在转录过程中，LncRNA不具有转录蛋白质的能力，因此曾被广泛认为不具有任何生物学功能，是基因组转录过程中的“噪音”或“暗物质”［6］。随着高通量测序技术迅猛发展，许多研究表明，LncRNA在调控细胞新陈代谢、生长、增殖和凋亡等多方面中发挥重要作用。其中LncRNA在肿瘤发展机制研究日益深入，研究表明LncRNA可以通过调节蛋白活性、影响转录模式、调节RNA加工及维持细胞结构稳定性等机制，影响肿瘤相关基因的表达［7］。在肝癌细胞里，LncRNA可以扮演海绵RNA或竞争性内源RNA角色，与其miRNA反应元件竞争结合miRNA，从而抑制miRNA表达，实现在转录后水平调控miRNA靶基因表达。因此异常表达的LncRNA、miRNA以及相关蛋白可能通过某种通路共同调控肝癌细胞的生长和转移［8-10］。

2 促进肝癌侵袭转移相关LncRNA基因

2.1 肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)LncRNA MALAT1首次在非小细胞肺癌中被发现。MALAT1基因定位于染色体11q13.1，全长约6.7kb，普遍表达于人类和鼠的细胞中［11］。研究表明，LncRNA MALAT1与肝、胰腺、肺和膀胱等组织恶性肿瘤的进展有关，被认为是促癌基因类LncRNA［12-13］。zhou 等［14］发现 MALAT1 在 HCC 细胞中表达增加，运用定量实时聚合酶链反应分析发现在sh-MALAT1 HepG2细胞和15个肝癌组织中miRNA-204含量均显著下调，miRNA-204被认为作为MALAT1的潜在相互作用配偶体，共同调控肝癌进展。同时SIRT1被认为是HepG2细胞中miRNA-204的直接下游靶点。因此，MALAT1的过表达通过负调控减少miRNA-204的表达，进而发挥对SIRT1表达的沉默作用，从而促进HCC的侵袭和转移。Lai等［15］发现，MALAT1高表达显著增加了肝移植患者肝癌复发的风险。目前研究迹象表明，MALAT1与HCC的侵袭转移具有密切关联，MALAT1表达量可以作为预测肝癌复发转移的独立因素，可能为治疗肝癌复发转移提供新的靶点。但最新的研究显示MALAT1 可以抑制乳腺癌的转移能力［16］，推测MALAT1可能在不同的肿瘤之间存在不同的表达通路。

2.2 HOXA远端转录本(HOXA distal transcript antisense RNA,HOTTIP)LncRNA HOTTIP最初于躯体远心端（如手足部和包皮）中成纤维细胞中发现。HOTTIP基因位于HOXA基因簇的5端（染色体7p15.2），因而被称为“HOXA远端转录本”，属于促癌基因类 LncRNA［17］。Tsang等［18］研究表明，在HCC细胞里HOTTIP表达量普遍上调，体外沉默HOTTIP表达可以明显抑制HCC细胞的增殖，显著降低肝癌的致瘤性。在裸鼠原位移植模型中发现，HOTTIP表达下调的小鼠里，肝癌远处转移能力明显抑制（尤其肺部）。进一步研究发现，在HCC细胞中，miRNA-125b作为HOTTIP的转录后调控下游，HOTTIP过表达可能导致miRNA-125b表达的缺失，从而加强肝癌的侵袭和转移能力。因此，HOTTIP可以通过调控miRNA-125b表达，在促进肝癌侵袭和远处转移中发挥重要作用。

2.3 内含子转录本1(SPRY4 intronic transcript 1,SPRY4-IT1)SPRY4-IT1属于LncRNA的一种，位于人类基因组5p31.3区域。SPRY4-IT1可以通过调节肿瘤细胞周期蛋白表达、染色体基因活性调控和信号分子的传递等过程，影响肿瘤细胞的增殖、侵袭等生物学过程［19-20］。Khaitan等［21］发现 SPRY4-IT1能激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，增强细胞凋亡、诱导增殖和增强转移的能力，进而发挥促癌作用。另有研究表明，SPRY4-IT1在HCC细胞中表达明显上调，通过调节上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程参与肝癌细胞侵袭转移过程［22］。Zhou等［23］发现，过表达的SPRY4-IT1能够上调Twist1和Vimentin表达，抑制E-cadherin转录，从而促进HCC组织EMT过程，增强肝癌的生长、侵袭能力，加大肝癌肝外转移几率。目前研究表明SPRY4-IT1能够促进肝癌的生长，在影响肝癌侵袭转移中也发挥重要的作用，同时也有望为治疗肝癌复发转移提供新的靶点。

2.4 肿瘤相关长链非编码RNA(cancer-associated region long non-coding RNA,CARLo-5)CARLo-5定位于人类基因组8q24区域，被认为在细胞周期调控和肿瘤的发展中发挥一定的作用，与癌症的易感性有关［24］。研究显示，HepG2肝癌细胞中CARLo-5的上调可以明显促进肝癌的增殖和迁移能力，CARLo-5的过表达与HCC患者预后不良有关［25］。另有研究显示，transwell细胞侵袭试验提示过表达CARLo-5的HCC细胞浸润侵袭能力加强。同时，QRT-PCR结果提示miRNA-200b（被认为是肝癌的抑癌因子）表达水平下降，并且与CARLo-5表达量存在一定负相关关系。进一步研究其机制发现，CARLo-5与EZH2共同沉默miRNA-200b的表达，从而发挥促进肝癌侵袭转移［26］。因此CARLo-5的表达可以作为提示患者预后的独立因素，抑制CARLo-5表达为防治肝癌生长转移提供新的思路。

2.5 结肠癌相关转录本2（Colon cancer-associated transcript 2,CCAT2）CCAT2位于人类基因组8q24区域，在肿瘤的生长、转移以及使相关染色体结构失稳发挥一定作用。CCAT2过表达可以促进乳腺癌、肺癌和胃癌的侵袭转移能力［27］。Chen等［28］研究显示，HCC组织中CCAT2的表达明显高于正常组织，体内外的试验均提示CCAT2表达能促进HCC细胞增殖和肿瘤生长。荧光素酶报告和芯片分析显示FOXM1可以直接与CCAT2启动子结合并激活其转录，因此CCAT2与FOXM1之间存在某种正反馈调节模式，共同调控HCC的进展。另有研究表明，低表达CCAT2的HCC细胞肝癌侵袭转移能力明显降低，对HCC组织进行QRT-PCR试验发现，CCAT2通过调节snaiL2诱导的EMT反应影响HCC生长、侵袭能力，因此CCAT2可能通过与FOXM1正反馈调节或诱导snaiL2表达等途径，促进肝癌的EMT进展，在肝癌侵袭转移的过程中起关键作用［29］。

2.6 肝癌高表达转录本(highly up-regulated in liver cancer,HULC)HULC位于基因组6p24.3区域，长约为1.6kbp，包含两个外显子，在人类恶性肿瘤中普遍高表达［30］。HULC被认为是HCC中重要的致癌LncRNA，HULC在HCC组织中表达显著升高，明显促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力［31］。当敲除USP22和COX-2相关基因，HULC诱导的HepG2细胞的存活率显著降低。同时，细胞集落形成试验也显示沉默USP22和COX-2可以明显抑制HULC诱导的HepG2细胞的生长，提示HULC可以通过USP22/COX-2轴在HCC的增殖中发挥重要作用［32］。最新的研究表明，HULC能够抑制PTEN、miRNA15a的表达，增强肿瘤细胞的自噬能力。同时，通过增强LCI到LC3的自噬过程促进HCC本身的自噬，从而促进肝癌细胞在体内的恶性生长、增殖和转移能力［33］。目前研究结果显示HULC可以调控多个信号通路增加肝癌的生长速度，在促进肝癌的侵袭转移中发挥重要作用，有望为治疗肝癌发展转移提供的新靶点。

2.7 转化生长因子β活化长链非编码RNA(long noncodingRNA activatedbyTGF-beta,ATB)LncRNA ATB作为新发现的LncRNA，位于14号染色体上，被认为参与肿瘤进展和转移的过程。研究表明，ATB在结直肠癌、肾细胞癌和乳腺癌中高表达，与肿瘤转移、血管侵袭过程密切相关［34-36］。Yuan等［10］研究首次发现肝癌细胞中LncRNA ATB的表达异常升高，明显促进HCC细胞EMT的进展。在裸鼠原位肿瘤模型里发现过表达的LncATB可以明显促进HCC细胞的肝内、肠系膜、肺和隔膜等远处转移。当抑制ATB的表达，显著降低了肝癌细胞的肺转移能力。这些结果均提示ATB能够明显加强肝癌肝内外转移的几率。通过对RIP-SEQ和转录组分析，ATB可以与白细胞介素-11（interleukin-11，IL-11）mRNA结合，促进IL-11分泌。在裸鼠异种移植模型中显示，HCC细胞分泌的IL-11有助于ATB发挥肝癌远处定植作用。而HCC细胞中IL-11的缺失，减弱了ATB的远处定植作用，但其过程并没有诱导或逆转EMT的发生。因此，ATB可以调控EMT进展对肝癌的局部侵袭发挥作用，同时也能通过促进IL-11的分泌增加肝癌远处转移的几率。

3 抑制肝癌侵袭转移相关LncRNA基因

3.1 LncRNA癌易感性候选基因2(cancer susceptibility candidate 2,CASC2)LncRNA CASC2位于人类基因组10号染色体上，属于抑癌基因类LncRNA［37］。目前研究提示，CASC2 参与多种恶性肿瘤发展及侵袭转移的过程。Wang等［38］研究利用双荧光素酶报告试验、RIP试验和生物素下拉试验发现CASC2在HCC细胞中表达减少，并通过参与CASC2/miRNA-367/FBXW7轴抑制HCC细胞的侵袭、转移和EMT进展，甚至逆转其EMT进展。同时建立老鼠肺转移模型，结果表明CASC2过表达明显降低了原发性肝癌肺转移概率。另有研究表明，CASC2过表达可以降低肝癌侵袭转移能力，并通过灭活蛋白激酶信号通路促进细胞凋亡，从而降低肝癌细胞远处转移能力［39］。因此CASC2可能通过多条信号通路降低肝癌远处转移的发生率，但具体机制还有待进一步研究。

3.2 LncRNA含铜胺氧化酶4的假基因（amine oxidase, copper containing 4, pseudogene，AOC4P）LncRNA AOC4P是一种肿瘤抑制因子，位于人类基因组17q21.31区域。Wang等［40］发现，与邻近正常组织相比，HCC组织中AOC4P表达明显下调，并且AOC4P低表达多提示患者预后不良。此外体外功能分析显示高AOC4P表达可以通过抑制EMT过程显著降低HCC细胞增殖和侵袭转移能力。在裸鼠进行体内异种移植试验和尾静脉迁移试验显示，AOC4P高表达可明显减少肿瘤生长速度及肺转移几率。进一步探讨肺转移机制试验发现，AOC4P可能通过与Vimentin蛋白结合，促进其降解从而抑制EMT过程，进而发挥抑制肝癌侵袭进展和远处转移作用。其他研究也表明，HCC组织中AOC4P表达下调与肝癌的肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期等多种临床表现具有一定相关性，AOC4P表达水平的降低提示患者的预后不良［41］。

4 展 望

肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类身体健康。虽然，以“手术治疗”为主的治疗方式使肝癌治疗水平得到了一定的提高，然而肝癌术后复发转移率仍高居不下，其术后5年生存率仅为30%～50%。肝癌发生侵袭转移主要通过两种方式：肝癌细胞直接侵犯肝内门静脉分支，形成门静脉癌栓，阻塞门静脉主干导致门静脉高压和肝功能衰竭。肝癌合并门脉癌栓形成主要发生在肝癌的中晚期阶段。另外，癌细胞可侵入肝内微循环系统经脉管系统引发肝内甚至体循环的广泛播散，出现肝内多发转移或肝外远处转移，最终导致患者的死亡。究其原因，肝癌的浸润、转移是由一系列基因共同参与调控的复杂过程，其中涉及到肿瘤细胞黏附、增殖、运动、免疫、微血管形成和分泌代谢能力等多个因素。由此可见，积极探索新的肝癌干预基因靶点，深入开展基因研究，探索肝癌侵袭转移的过程，对肝癌复发转移的防治提供新的途径与策略将具有十分重要的意义。

LncRNA在肿瘤形成过程中的表达机制颇受关注，目前发现LncRNA主要通过3个方面调控靶基因表达：①表观遗传学：干扰转录因子与启动子结合、诱导蛋白质修饰和染色质发生重构等方式影响编码基因表达；②转录调控：和靶蛋白结合后影响基因转录；③转录后调控：能作用蛋白结合伴侣或调节蛋白的亚细胞定位影响蛋白活性等，进而影响肿瘤的进展［42-44］。比如，在结直肠癌中LncRNA-422可以通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路表达，降低结直肠癌的增殖迁移能力。又比如，LncRNA Pint可以与PRC2结合 ，诱导TGF-β、MAPK和p53信号通路等相关基因的表达沉默，进而发挥抑癌作用［45-46］。LncRNA在肝癌的发展过程中同样也发挥重要作用，LncRNA可以通过与某些蛋白质及miRNA互相作用，共同参与调控肝癌侵袭转移进展。研究发现，一个LncRNA可以调控多个miRNA的表达，一个miRNA存在多个靶基因，这说明LncRNA可能通过调控多条信号通路互相协作，共同促进肝癌细胞的侵袭转移［47-48］。

GiannelliI等［49］研究已经证实，EMT是影响肿瘤侵袭和转移的重要因素，同时也包括原发性肝癌在内的癌症进展、肝外转移的关键过程。研究表明，LncRNA ATB可通过作用与miRNA200-ZEB-EMT轴从而促进HCC细胞转移［10］。由此可见，LncRNA可以通过EMT过程发挥促进肝癌侵袭转移的重要作用，但具体机制有待进一步探索。另有研究认为，LncRNA也能通过其他方式影响肝癌侵袭进展，Yuan等［50］发现，在微血管癌栓中，长链非编码RNA肝癌微血管浸润相关LncRNA（long noncoding RNA associated with microvascular invasion in hepatocellular carcinoma，MVIH）普遍高表达，并且LncRNA-MVIH参与促进微癌栓向其他器官转移，进而形成多个肝内外转移瘤过程。MVIH的表达可以明显抑制肝癌细胞分泌磷酸甘油酸激酶1，进而减弱其对血管生成的抑制作用，最终加速肝癌组织新生血管的形成，促进肝癌的生长和侵袭转移能力。

综上所诉，LncRNA可以通过多种方式调控肝癌的进展。目前LncRNA在肝癌领域的研究多倾向于探讨单条通路对肝癌生长、侵袭转移的影响，系统研究一个LncRNA参与多种途径共同调控肝癌进展、侵袭转移的研究发现则较少。许多LncRNA在肝癌组织中表达缺失，被认为与肝癌的侵袭转移具有直接或间接的联系。但关于LncRNA影响肝癌侵袭转移的具体机制仍需进一步探索，大量的相关生物学功能和分子机制也有待发现。肝癌侵袭转移是多因素相互作用的复杂过程，开展筛选肝癌转移相关特异性LncRNA，研究其生物学功能和分子机制，并且深入探讨LncRNA参与多条信号通路之间的相互关系，将为进一步揭示肝癌侵袭转移过程中的分子机制做出巨大贡献。

随着研究的不断深入，LncRNA也将有望成为早期预测肝癌复发转移的标志物，有助于肝癌的早期诊断与治疗。同时，LncRNA也可能为肝癌治疗提供多个有效的治疗靶点，为预防肝癌复发转移提供新的方向和治疗手段。