miRNAs在肝细胞癌中的研究进展

陈彩霞综述，苏丽娅，任建军审校

0 引 言

肝是哺乳动物最大的腺体，具有多种内分泌和外分泌功能，包括碳水化合物、脂质和氨基酸代谢、尿素合成、药物和毒性内源性化合物的解毒、胆汁产生和血浆蛋白质分泌。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）约占全部肝癌病例的90%，每年造成50万人死亡，严重危害人类健康［1］。HCC涉及多种危险因素，包括慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B vi⁃rus，HBV）或丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、性别、年龄、乙醇和黄曲霉毒素B暴露等。HCC还涉及遗传和表观遗传变化，包括突变易位、扩增或缺失、染色质重塑、DNA甲基化改变和非编码RNA表达［2］。目前，手术肝切除和肝移植仍是HCC患者的主要治疗手段。切除术对HCC患者具有良好的疗效，当肿瘤独立且＜2cm时，切除后患者存活率接近70%，遗憾的是，只有10%左右的患者符合手术条件。为改善HCC患者预后，迫切需要了解HCC发病的分子机制，找出有效的治疗策略，更好的理解分子机制有助于区分进展型和非进展型HCC，对于HCC早期诊断、探索新型的预后指标和治疗靶点至关重要。

MicroRNAs（miRNAs）是由18-25个核苷酸组成的短链非编码RNA，由pri miRNAs加工而成，通过直接与靶基因3′非编码区域（3′-UTRs）的特异序列结合，有助于靶基因表达的转录调控，现在已证实其至少影响人类30%的基因表达，成为当今调控基因表达最丰富的调控者。在人类癌症中miRNAs通过各种机制（包括miRNAs基因的扩增或缺失、miR⁃NAs的异常转录及表观遗传改变失调）导致表达失调。在某些条件下，miRNAs可作为致癌基因或肿瘤抑制基因，从而调节肿瘤的发生发展。失调的miRNAs能够介导癌症的发生及发展，包括维持增殖信号传导、逃避生长抑制剂、抵抗细胞死亡、激活侵袭和转移通路以及诱导血管生成。越来越多的研究已将miRNAs作为人类癌症诊断、预后和治疗靶点或潜在生物标志物［3］。本文通过结合国内外文献，对近年来miRNAs在HCC诊断、治疗及预后的相关进展作一综述。

1miRNAs与HCC的诊断

1.1 miRNA表达谱一些关于HCC的miRNA表达谱的研究结果显示，miRNA表达与肝细胞癌发生、发展和治疗之间存在一定的相关性［4］。Wei等［5］发现，一个含有30种miRNA的表达谱能够区分HCC和相应的非癌性肝组织，且可用于HCC的分类和预后。此外，Jiang等［6］对28对肝细胞癌和癌旁良性组织之间发现了差异表达的16种miRNA。用这16种miRNA的表达谱区分HCC和非癌性肝的分类准确率达96.4%。在这16种miRNA中，有5种miR⁃NA存在于Wei等［5］发现的30种miRNA的表达谱中。同年，又发现69种miRNA显示在中国东部地区的78对肝癌和相应的非癌性肝组织中表达差异显著，89.7%的样本可通过69-miRNA特征正确分类［5］。有趣的是，有 11 种 miRNA（hsa-let-7i、hsamiR-103、hsamiR-106b、hsa-miR-130b、hsa-miR-18a、hsa-miR-20a、hsa-miR-20b、hsa-miR-210、hsa-miR-221、hsa-miR-451和hsa-miR-93）在69种miRNA的表达谱和Wei等［5］的30种miRNA表达谱重合。经过验证，研究人员鉴别出的这30种miRNA表达谱鉴定肝癌和非癌症肝的准确率为99.2%，且准确性高于以前报道的所有miRNA表达谱。

有研究使用血清样品发现，miR-25，miR-375和let-7f的组合可将健康对照样品与HBV相关HCC样品区分开，而miR-16，miR-195和miR-199a的组合可区分HBV与慢性HBV感染相关的HCC［7］。在验证研究中，发现miR-15b和miR-130b的组合能够有效预测HCC，并能早于甲胎蛋白检测HCC［7］。miR-15b和miR-130的组合也能够以高灵敏度和特异性区分HCC和健康人标本，这些为HCC的早期发现提供了希望。在最近的一项研究中，应用miRNAs表达谱鉴定HBV-或HCV-HCC相关的肝组织，结果发现40个差异表达的miRNAs，其中10个严重失调，但是与HCC患者相比，仅有miR-126和miR-142-3p在患有HCC的HBV患者的血浆中升高［8］。在回顾性研究中，HCC肿瘤组织中miR-15b，miR-21，miR-130b和miR-183相对于相邻的非肿瘤组织呈上调状态；在血清和细胞培养上清液中可检测到这些miRNAs的水平，手术切除后血清水平显著下降［9］。

与某个单一miRNAs相比，miRNAs表达谱用于HCC的诊断或预后预测，克服前者的偶然性及个体差异性，更具有临床指示意义。对于HCC和非癌肝组织的miRNAs差异表达的研究表明，miRNAs表达谱可能是一种潜在的诊断工具，不仅能够帮助探索肝癌发生的分子机制，还能为肝细胞癌治疗的新分子靶点提供线索。

1.2 miRNA122miRNAs在哺乳动物中的发现源于土拨鼠肝肿瘤基因改变的研究。1989年，有研究描述了与这一肿瘤相关的c-myc重排基因及名为“hcr”一种不寻常的转录物，同时将这一转录本定性为内切核酸酶处理后的肝特异性非编码的核物质，而“hcr”正是miR-122的前体。在目前的理解中，预计包含“pri-miRNA”的hcr转录物的部分将会被内切核酸酶处理，从而形成66nt长的“premiRNA”，其呈现具有79%碱基配对的发夹结构，并最终被内切酶Dicer切割形成成熟的miR-122。2002年，从不同小鼠组织中进行miRNA的系统克隆和测序，结果发现miR-122在肝中是含量最丰富的miRNA［10］。此外，在土拨鼠、人类肝、人类原代肝细胞和培养的源于肝的细胞（如小鼠Hepa1-6细胞和人类Huh7细胞）中均发现了miR-122［11］。更进一步的研究表明，在小鼠胚胎生长过程中，miR122在小鼠胚胎肝中的表达逐渐上调，通过抑制其下游靶基因调节肝细胞的增殖和分化，从而保障肝发育顺利进行［12］。然而，miR-122在患HCC的人类和啮齿动物肝中显著并特异性地下调［13］。这说明，肝中miR122的表达调控作用因肝状态而异，且在正常肝的生长发育及肝癌发生中的有一定作用。研究人员进一步在肝癌来源的细胞系中发现，miR-122可调节细胞周期蛋白G1的表达，且原发性肝癌中miR-122a和细胞周期蛋白G1的表达呈负相关［14］。细胞周期蛋白G1不仅参与DNA复制还促进凋亡和信号转导中起作用，并推断miR-122可能是通过细胞周期蛋白G1介导HCC的发生与发展。

HCC患者与健康人及其他肝疾病患者肝肿瘤组织、血清、血浆和尿液中的miRNAs概况各不相同。虽然miR-122在原发性HCC肿瘤中表达下调，但是在HCC患者血清中表达上调，这可能是miR-122从肿瘤进入循环中释放造成的结果［15］。另外，研究人员通过比较成人和/或胎儿肝中miRNAs的表达发现，miR-122是成年肝中表达最高的miRNA，而miR-92a和miR-483在胎儿肝中更为特异［16］。因此，在寻找参与肝疾病（尤其HCC）的miRNAs失调的途径时，miR-122充当了举足轻重的角色。

1.3 miR-199a*(miR-199a-3p)miR⁃199a基因位于染色体1和19上，miR-199a-1位于染色体19p13.2上的Dynamin 2（DNM2）基因的内含子中。miRNA基因可表达miRNA成熟链或与其配对的miRNA*链。尽管miRNA链通常较miRNA*链表达水平更高，但肝组织中的miR-199a基因并非如此，其中miR-199a*表达较miR-199a表达高 100至 300倍［17］。确实有研究表明，miR-199a和miR-199a*在肝癌癌组织中的表达量较相邻的癌旁组织降低了约2倍［17］。研究人员通过定量聚合酶链反应（qPCR）测定了miR-199a和miR-199a*在各种HCC细胞系（Skep-1、SNU449、SNU182、HepG2、Hep38、Huh7 和 PLC/PRF5）中的表达，结果显示，在任何一种均不能检测到成熟的miR-199a和miR-199a*，但在来自各种肿瘤（包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、头颈癌、胰腺癌和血液恶性肿瘤）的37种细胞系中却非如此发现［18］。因此，HCC肿瘤标本中miR-199a*的水平有所下降，且在各种HCC细胞系中无法通过qPCR检测。而且miR-199a*的这种表达失调一般在易患肝癌的条件下发生，包括脂肪性肝炎、肝纤维化、肝功能衰竭和 HCC［19］。因此，miR-199a*可能在未来作为HCC早期诊断的分子标志物。

miR-199a*调控细胞功能也可能有助于HCC的发展。miR-199a*能够靶向作用于c-MET原癌基因。c-MET为肝细胞生长因子受体产生跨膜酪氨酸激酶受体。c-MET蛋白通过诱导细胞运动、侵入和抑制细胞凋亡来促进侵袭性生长。活化的c-MET增加与HCC患者存活率差有关［20］。miR-199a*模拟物能够逆转MET诱导的多种癌细胞系的侵袭性生长。在增殖活跃的肿瘤中，miR-199a/a*基因座被严重甲基化，唯一表达这些miRNA的细胞是肿瘤内的成纤维细胞。将miR-199a*导入肿瘤细胞时，能够诱导肿瘤细胞凋亡［18］。Fornari等［21］证实，向HCC组织添加miR-199a*通过与c-MET产生相互作用导致G1期细胞周期停滞。增加miR-199a*水平导致细胞对阿霉素敏感性增加、对缺氧的敏感性增加、细胞凋亡增强、G1期细胞周期停滞和侵袭能力降低［22］。miR-199a*最终的验证靶点是ERK，虽然这是c-MET的下游靶点，但是被miR-199a*独立下调。miR-199a*似乎对c-MET信号传导途径具有多重控制作用，因此，miR-199a*表达可能在HCC中是动态变化的。

1.4 miR-224关于HCC中的血浆/血清miRNA，不少研究小组已经报道了在血浆/血清中循环miR⁃NA在临床应用中的潜在用途。然而，这些miRNA不一定是HCC的候选者，有必要寻找一些不依赖肝基础疾病和肝功能情况且对HCC早期检测和治疗更敏感、更有研究及应用前景的候选者。关于既不依赖肝疾病及肝功能又对早期HCC检测敏感性强的理想血液分子生物标志物的报道较少。近期，有研究人员通过NCBI数据库中的HCC系统回顾和各种验证分析选择候选miRNA，并将血浆miR-224鉴定为HCC诊断和治疗的新型生物标志物［22］。具体而言，HCC患者中血浆miR-224的表达水平显着高于健康志愿者。此外，使用血浆miR-224的HCC检测的优点在于，此方法不受基础肝病和肝功能障碍程度的影响，即使在肝硬化中也是如此。这些发现可能有助于HCC治疗过程中更敏感的诊断和更好的诊疗决策，并且证明miR-224作为一种新型的、非侵入性的基于液体的HCC的生物标志物的意义。miR-224主要通过信号通路（如NF-κB炎症信号通路和TGF-β信号通路）调节发挥作用［23］。该分子也被报道为细胞周期进程的主要调节者，并且其过表达会导致G1/S检查点释放，随后加速细胞生长［23］。在将这些研究结果转化为HCC患者的临床应用及非侵入性筛查之前，许多问题有待解决。如应该使用不同体液和高通量平台的方法寻找其他更敏感的候选miRNA作为基于液体的生物标记物来诊断和监测HCC。

2miRNAs与HCC的治疗

2.1 miR-127miR-127位于Dlk1-Gt12印迹区域内。miR-127与miR-433成簇表达，且这两种miR⁃NA主要转录物受核受体信号（包括小异二聚体伴侣和雌激素相关受体γ）的调控。目前，还未报道miR-127的体内生理功能的相关信息；在病理作用方面，尽管有关于其与肺癌、宫颈癌及直肠癌的相关报道，但关于其在人类肝癌中的潜在作用仍未有定论。

MHCC97H是一种转移性肝癌细胞系，其侵袭性较其他HCC细胞（包括HepG2、Hep3B、Huh7和MHCC97L）强。研究发现，miR-127的过度表达减少了约40%的MHCC97H的迁移率；相反，使用miR-127特异性抑制剂（抗-miR-127）敲低内源性miR-127，有助于MHCC97H细胞迁移，主要机制是影响了转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）下游的靶基因基质金属蛋白酶13［24］。这些结果提示miR-127可能具有抑制HCC侵袭及转移的作用。这与之前在HCC发生过程中，大鼠肝中miR-127显著下调的研究结论矛盾［25］，所以，miR-127在HCC中的功能存在争议，有待进一步深入研究，以探索miR-127在HCC中的确切功能，将其开发为一种HCC的治疗剂。

HCC的发病率已经转向相对较低的年龄，因此肝癌已成为中国乃至世界的主要健康问题。TGF-β在与HCC进展和转移相关的基因特征中占有重要地位，表达TGF-β的肿瘤具有侵入性强、复发率高的特点。所以，根据miR-127能够拮抗TGF-β介导的HCC细胞迁移，可将miR-127开发为HCC潜在的肿瘤抑制剂，这可能有助于miRNAs相关的肿瘤疗法的发展，但需要进一步研究验证。

2.2 miR-148amiR-148a可通过多种机制介导HCC的发生与发展。在培养的HCC细胞和小鼠异种移植模型中，miR-148a通过抑制不同的癌蛋白信号通路来抑制肿瘤间质转化、侵袭和转移，发挥了内在的肿瘤抑制作用［26］。miR-148a缺陷小鼠通过多种复杂机制促进二乙基亚硝胺（diethylnitrosa⁃mine，DEN）诱导的HCC发生，且通过慢病毒转染重新表达miR-148a可逆转肿瘤易感性，说明miR-148a表达恢复可抑制DEN诱导的小鼠肝癌发生，此过程可能是由miR-148a直接或间接抑制多种功能相关基因（编码促进HCC进展的关键因子，如c-Myc、Dn⁃mt1、Wnt1、Ybx1、Sirt7 和 Pgc1α）的表达所介导的［27］。最近研究显示，使用miR-148a模拟治疗Pten基因敲除的HCC小鼠，能够显著抑制肿瘤生长速度和肿瘤发展，这些作用部分由IkB激酶α/NUMB/NOTCH信号介导产生，与肿瘤细胞分化有关［28］。因此，miR-148a可能成为HCC患者miRNA替代治疗的候选者。miR-148a不仅可能作为HCC诊断和预后的生物标志物，还有望成为HCC治疗的靶点。

2.3 miR-122耐药性的发展是癌症化疗失败的主要原因。肝癌患者易对常规化疗药物产生耐药性。因此，提高肝癌化疗的疗效显得十分迫切。miR-122在HCC中的表达明显低于正常肝组织，在HCC的生理和病理过程中起着多种作用［15］。最近的研究结果显示，miR-122可通过下调耐药相关基因（包括多药耐药基因-1、谷胱甘肽S转移酶和多药耐药相关蛋白）以及通过调节细胞凋亡相关基因表达来改变HCC细胞的化疗敏感性［38］。

2.4 miR-139-5p癌细胞能够通过有氧糖酵解优先代谢葡萄糖，为他们生存提供优势。研究表明，miR-139-5p过表达可通过抑制有氧糖酵解从而抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭。与癌旁组织相比，HCC中miR-139-5p表达降低且参与调节HCC细胞中的有氧糖酵解及HCC细胞增殖和转移，这在癌症基因组图谱中得到证实［30］。因此，从代谢学方面寻找HCC治疗新靶点具有不可忽视的科学意义。

3miRNAs与HCC的预后

3.1 miR-148amiR-148a在各种癌症（包括胃癌、乳腺癌和泌尿生殖系统癌症以及神经胶质瘤）中异常表达，并已被鉴定为在癌发生的分子机制中具有关键作用的致癌或肿瘤抑制剂［31］。miR-148a的功能性作用对于发现新的肿瘤分子标志物和确定潜在的治疗靶点至关重要。其异常表达与HCC的某些临床病理特征（包括转移、复发和预后）也密切相关。研究人员发现，与癌旁组织相比，HCC组织中miR-148a显著下调；此外，转移性肝肿瘤微血管miR-148a的表达水平较非转移性低；且miR-148a的低水平表达与甲胎蛋白水平高、TNM分期差、OS低以及无复发生存率低相关，也意味着转移性肝肿瘤微血管miR-148a表达较低的HCC患者预后较差［32］。mir-148a还与HCC分期、分化程度及浸润有关，Pan等［33］发现mir-148a与HCC TNM分期和荚膜浸润呈负相关；与高分化HCC相比，mir-148a在低分化HCC中的表达相对较低。因此，miR-148a不仅可能作为HCC的治疗靶点，还有望在HCC预后方面有所贡献。

3.2 外泌体外泌体是由许多细胞类型分泌的微泡，其作为生物信息交换的物质载体，能够通过递送一系列生物分子（包括蛋白质、脂质和核酸）调节细胞微环境。肿瘤细胞衍生的外泌体参与细胞间通讯、肿瘤血管生成、肿瘤转移以及药物和放疗抗性［34］。

肝癌细胞的旁分泌或自分泌外泌体富含小RNA和蛋白质，这些RNA和蛋白质可通过外泌体转移以促进HCC细胞转移［35］。由于外泌体的自然转运作用，RNAs由外泌体携带可到达并影响远处的细胞从而产生不同的细胞表型，这可能是肝癌远端转移的重要机制。如HCC细胞通过神经酰胺将选择性miRNA包装到外泌体中。这些外泌体可通过调节自身表达以及靶细胞TGF-β活化激酶1的下游信号传导途径，从而调节转化细胞的生长和凋亡［35］。miRNAs可通过外泌体在细胞间转移，并且可影响靶细胞。如外泌体可在Huh7和Hepg2人肝癌细胞系之间转移miR-122。Huh7细胞衍生的外泌体将miR-122转移至Hepg2细胞，可抑制Hepg2细胞的生长并加速这些细胞的老化［36］。另外，外泌体miR-718可调节靶基因同源框B8以抑制HCC细胞的分化。在肝移植后患者中，血清外泌体miR-718水平较低者肿瘤复发率较高［37］。因此，外泌体可在细胞之间转移miRNAs，这些miRNAs调节靶细胞中基因的表达且在肿瘤侵袭和转移中起重要作用。另外，某些RNA可通过外泌体转移到其他细胞和组织中，并为肿瘤细胞转移建立适当的微环境。

外泌体是一类新型细胞间信号介质，其在HCC的发生发展中具有重要的作用，因此，其在检测和治疗该疾病中具有潜在的临床应用价值，然而，外泌体在HCC侵袭和转移中的具体机制尚不完全清楚，这一局限性阻碍了其在诊断和治疗HCC方面的发展。将来的研究应该集中在确定其作用机制并确定HCC的潜在诊断和治疗方法。HCC中发生多种组织病理学改变，包括血管生成和血管渗透性增加，这与肿瘤发生、发展、侵袭和化学抗性相关。由于已知HCC衍生的外泌体在肿瘤微环境中起重要作用，因此对HCC衍生的外泌体在血管生成、血管功能和结构中作用的更多了解将有助于我们对抗血管生成治疗的理解，并可能提高化疗和放射治疗的疗效。

4 结语与展望

由于miRNAs表达的微小变化可能影响数百种靶基因的表达，也可能使转录组发生显著变化，所以，miRNAs调控网络参与一些疾病的发生发展。目前，人类基因组中已经鉴定出约500个miRNAs基因，在抗逆性、代谢、防御致病性感染、细胞增殖和细胞死亡的协调、肿瘤发生中起重要作用。有确凿证据表明，miRNAs在调控肝细胞生长、应激反应、代谢、病毒感染和增殖、基因表达和维持肝表型方面有重要意义［38］。肝纤维化是HCC发生发展的一个重要因素，有人报道了miRNA-21能够促进肝纤维发生，所以降低miRNA-21表达可能成为有助于抑制肝纤维化发展，进而预防HCC发生［39］。所以，miRNAs不仅在HCC的诊断、治疗及预后中发挥一定作用，其在HCC的预防方面也有重要作用。HCC中miRNAs的表达水平或功能失调已是众人皆知，因此，越来越多的研究着力于验证miRNAs在癌症发生、进展和转移中发挥重要作用，并探讨这些明星分子是否能够成为癌症预后的强大生物标志物或治疗靶点，为HCC的诊断及治疗提供帮助。

尽管miRNAs作为HCC的生物标志物具有很大的潜力，在许多研究中，评估了多种miRNAs联合预测HCC的效果，但是由于miRNAs来源各异，研究人员所采用测定方法不一，这些因素增加了研究小组对HCC生物标记研究的困难性。此外，使用miR⁃NAs芯片对候选miRNAs进行初筛选的研究方法存在一定的局限性，这种方法通常只包含一组有限的探针，这些探针可能不包括最近鉴定的miRNAs，也不能够防止与未表征的miRNAs交叉杂交。所以，开发miRNAs芯片技术，无论miRNAs芯片单独使用还是与其他生物标志物结合使用，最终均有助于判断样品的肝功能及HCC的发展进程，并有助于选择治疗方法，甚至能够帮助建立HCC预后的生物标志物库。此外，监测miRNAs图谱中的变化可在肝功能变化前发现HCC，从而可进行更早更有效的治疗并且改善患者存活率。特别是在慢性乙型肝炎患者人群中，急需这种改善。

HCC死亡率在恶性肿瘤中居第二位，且治愈性差、复发率高、耐药频发且预后不良［40］。目前，仍无创新且有效的治疗方法来满足临床需求。肝移植有利于不适合手术切除的患者，图像引导消融是最常用的治疗方法，但由于肿瘤大小各异，所以，此疗法受到一定的局限性。索拉非尼能够增加HCC患者生存率，也是唯一批准的用于治疗晚期HCC的一线药物，是晚期肝细胞癌的标准治疗方法，但由于其剂量相关的众多不良反应限制其高剂量使用，使患者产生耐药性；若与其他抗肿瘤药物联合使用，需考虑多药联合不良反应；所以，需要探索新型非常规药物（如基于miRNAs的寡核苷酸制剂）单独或与其联合治疗HCC。虽然靶向递送和治疗性miR⁃NAs的表达研究将可能是一个重大挑战，但是，更深入地理解miRNAs和其他非编码RNA的作用可能有助于HCC及其他癌症的耐受性治疗。RNA技术具有高效阻断体内特定基因表达的作用，该技术已广泛用于基因功能及基因治疗等方面的研究。郭固楠等［41］利用siRNA技术，发现了肝癌可能的治疗靶点。目前，人们正在探索用于抑制miRNAs功能的反义寡核苷酸方法和siRNA样技术以作为潜在的治疗剂。尽管RNAi技术的一些安全性问题仍有待解决，但这一疗法在未来可能成为肝疾病的一种有效治疗方法，并且可能为肿瘤治疗提供新策略，分子靶向药物单独使用或者与现有药物联合使用治疗HCC也是令人期待的。