胶质细胞源性神经营养因子干预视网膜色素变性给药方式的研究进展△

代贺华 李根林

作者单位：100730 北京市，首都医科大学附属北京同仁医院，北京同仁眼科中心，北京市眼科学与视觉科学重点实验室

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是常见的遗传性致盲眼底病，以夜盲、进行性视野缺损、特征性眼底改变及视网膜电流图(electroretinogram，ERG)显著异常或无波形为主要临床特征。据报道其患病率范围为1/5000～1/750[1]。目前RP的治疗方法主要包括药物治疗、基因治疗、细胞移植及视网膜假体等。在没有其他有效的替代治疗之前，临床RP患者仍以药物治疗为主[2]。药物治疗主要通过神经保护来延缓疾病的发展，其中神经保护药物主要依赖于神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)。NTFs可促进神经细胞生存分化，抑制细胞凋亡速度，提高光感受器细胞的生存能力。除来源于神经元和视网膜色素上皮细胞的NTFs，源于胶质细胞的NTFs日益受到重视，是目前学科研究热点之一。本文就胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)在干预RP方面的应用现状进行综述。

1 GDNF的生物特性

GDNF首次在大鼠的B49胶质细胞系中发现，最初将其描述为大鼠中脑多巴胺能神经元的营养因子[3]。GDNF是转化生长因子β超家族的成员之一[4]，对神经系统的发育、生长、损伤及修复等有重要的神经营养作用。GDNF发挥其生物学效应的主要受体：GDNF家族受体和介导受体酪氨酸激酶Ret，主要信号通路：丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)通路和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路[5]。

2 GDNF的神经保护作用

GDNF是迄今为止文献报道最强的多巴胺能因子，不仅可以保护多巴胺能神经元，还可以修复多巴胺能神经元[6]，因此GDNF在神经退行性病变的研究中受到学者的广泛关注。随着GDNF在神经系统变性疾病及缺血性脑血管疾病等治疗中应用研究的进展，人们开始重视GDNF在退行性视网膜病变的发生发展中的应用。

1993年GDNF首次被发现可以促进中脑多巴胺能神经元的存活[3]，随后GNDF又被证实可以增加突触数量[7]和促进各种神经元[8]的存活，包括神经节细胞[9]和光感受器[10]。视网膜的GDNF表达增加，可以延缓视网膜变性模型中的视杆细胞的死亡，并能降低严重氧化应激状态下的视网膜变性[11]。GDNF主要通过感光细胞介导的直接机制和Müller细胞介导的间接机制来发挥神经保护作用[12]。

3 GDNF的新型给药方式

由于GDNF的半衰期相对较短，生物利用度低，靶向细胞递送能力差，因此持续释放药物是必要的。虽然反复玻璃体内注射药物可以提高局部药物浓度，但这种给药方式有潜在风险，包括感染性眼内炎、眼压升高、视网膜血管闭塞和视网膜脱离[13]。为克服重复玻璃体内注射药物的并发症，GDNF长期递送系统如经病毒或非病毒介导的基因治疗，聚合物释放系统，以及细胞/细胞替代疗法[14]成为研究热点。现就近年GDNF的新型给药方式予以介绍。

3.1基因工程法介导的GDNF释药技术基因工程法介导GDNF释药技术根据载体的不同，可分为病毒和非病毒载体介导的GDNF释药技术。基因转染依赖于给药途径：视网膜下腔给药主要转染视网膜色素上皮细胞(RPE)和感光细胞，玻璃体腔给药主要转染神经节细胞[2]。

3.1.1经病毒载体介导的GDNF释药技术用于治疗RP基因治疗的病毒载体主要包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)等。AAV由于其安全性和易操作性而被优先用于视网膜的基因传递[15]。

Sanftner等[16]研究通过含有鸡的肌动蛋白启动子/巨细胞病毒立即早期增强子(the chicken-actin promoter/immediate early cytomegalovirus enhancer，CBA)的AAV载体驱动人GDNF基因，将AAV-CBA-GDNF转移到RP模型(TgN S334ter-4)视网膜下，通过对外核层厚度的形态学进行分析，视杆细胞的存活率增加，ERG大幅增加，视网膜功能得到改善。但是60 d后失去了治疗效果，可能是由于光感受器细胞分泌GDNF逐渐丧失。

Müller细胞贯穿整个视网膜，面向玻璃体面，并且本身释放NTFs[17]，即使视网膜神经元凋亡了，它仍可以继续提供NTFs，因此成为了基因导入的备选细胞。Dalkara等[18]设计了一个AAV衣壳变体——ShH10，通过玻璃体内注射，高效、定向转染Müller细胞，使Müller细胞过表达GDNF。ERG、外核层厚度、内丛状层的厚度和感光细胞外节段长度均证实了经玻璃体腔转导Müller细胞分泌的GDNF是治疗视网膜变性一个安全、有效和可持续的方法。

3.1.2非病毒载体介导的GDNF释药方式非病毒载体主要包括DNA纳米粒、阳离子聚合物型载体和脂质体载体等。

3.1.2.1DNA纳米粒介导GDNF的释药方式Ishikawa等[19]通过电穿孔将粒子携带的GDNF导入视网膜神经节细胞，改善视网膜神经节细胞的损伤程度。Touchard等[20]研究显示，在RCS大鼠睫状肌中单次电转移30 μg GDNF编码质粒后，持续产生GDNF至少7个月。形态学、ERG和视功能分析均表明这种GDNF的持续释放可延迟光感受器和视网膜功能丧失至少70 d，同时提出了高浓度的GDNF持续释放存在潜在的视网膜毒性。

3.1.2.2阳离子聚合物型载体介导GDNF的释药方式眼部给药肽(peptide for ocular delivery，POD)是一种新型的阳离子渗透肽，可以穿透视网膜的RPE、光感受器和神经节细胞[21]。当它与聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)结合(PEG-POD)时，可以将质粒DNA运输到成年小鼠视网膜的RPE。含GNDF的PEG-POD纳米颗粒(PEG-POD-GNDF)主要用来研究其抑制光感受器凋亡的能力。Read等[22]研究发现，将PEG-POD-GNDF注射到视网膜下腔后细胞凋亡率显著降低，光照14 d后外核层的厚度比对照组厚23.6%～39.3%，7 d后ERG的功能反应性较对照组高27%～39%，并活化了Müller细胞。Binder等[23]将PEG-POD、PCPG-GDNF NPs注入成年Balb/C鼠的视网膜下，3周后，减轻了蓝光引起的光感受器退化，37 d后结构和功能上得到持续挽救，注射77 d后仅结构上得到持续挽救。

3.2聚合物释放系统介导的GDNF释药技术微粒因持续释放活性物质而得到关注，2种不同结构类型的微粒通常用于递送活性物质：微囊和微球。

3.2.1细胞包囊技术及其介导的GDNF释药技术细胞包囊属于微胶囊结构，细胞包囊技术(encapsulated-cell technology，ECT)的目标是包囊细胞在靶位点上持续释放治疗药物，而不会引起任何免疫反应。进行临床试验的ECT设备有NT-501和NT-503，其中NT-503的临床试验因效果欠佳已被叫停，而NT-501仍处于2期临床试验[24]。近年来，在临床前研究中已经提出了各种ECT设计，特别是生物相容性好的藻酸盐和胶原基水凝胶系统在体外和体内的研究中均取得了可喜的成果。Wong等[25]研究报道了一个三维胶原微囊化培养系统，维持人胚肾(human embryonic kidney，HEK)293细胞的生长，在体外持续分泌GDNF长达30 d。复合胶原-海藻酸钠支架是一个相互渗透的网络，具有良好的生物相容性。Wong等[14]研究发现将HEK293细胞封装在由Ⅰ型胶原和海藻酸钠组成的玻璃体内注射凝胶中，在健康的大鼠眼睛里可以检测到GNDF的连续释放至少14 d。将凝胶植入营养不良的RCS大鼠眼内可以维持光感受器存活达28 d。

3.2.2微球技术及其介导的GDNF释药技术不同于微胶囊，微球(microspheres，MSS)内的活性物质是分散的，可生物降解的MSS是一种新兴的治疗眼慢性病的工具，它可以在靠近眼周和眼内的靶点释药，并且释药后被降解[26]。聚乳酸-乙醇酸(poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA)是最常用的生物可降解聚合物，其中艾尔建傲迪适(Ozurdex®)已经用于临床实践，由PLGA组成的眼内药物释放系统在体内逐渐降解为水和二氧化碳，并被眼内组织清除[27]。

Andrieu-Soler等[28]使用水-油-水乳化溶剂萃取蒸发将重组人神经胶质细胞源性神经营养因子封装于PLGA微球中，注入出生后11 d的rd1/rd1小鼠玻璃体腔内，于出生28 d时检查视网膜变性程度，显示小鼠视杆细胞光感受器变性显著延迟，视紫红质阳性信号增加，细胞外核层的细胞数目显著增加，ERG显示b波升高。García-Caballero等[29]研究中将GDNF和Vit E包装入PLGA微球内，显示在体外持续释放GDNF达24周，这种新剂型的GDNF/VitE单次注入兔眼玻璃体腔内，可持续释放GDNF至少6个月。

3.3细胞移植介导的GDNF释药技术近年来细胞移植干预视网膜疾病越来越受关注。Gregory-Evans等[30]利用胚胎干细胞来递送神经保护分子到TgN S334ter-4鼠的视网膜。将基因修饰后分泌GDNF的小鼠胚胎干细胞悬液注入出生21 d的TgN S334ter-4鼠玻璃体腔内，出生后90 d时在视网膜內界膜可检测到胚胎干细胞分泌绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，出生后45 d冰冻切片中显示分泌GFP的细胞整合到视网膜内层，但未迁移至外核层。在初始滞后期后，周边视网膜的感光细胞计数显著增高。Gamm等[31]向单侧RCS大鼠的视网膜下植入人神经前体细胞(human neural progenitor cells，hNPC)，hNPC经基因修饰分泌GDNF，出生后150 d，组织学显示hNPC在视网膜神经上皮与色素上皮层之间形成几乎连续的色素层，在视网膜内层也有分布，同时观察到存留的视锥细胞。Hu等[32]研究显示，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)对视网膜神经节细胞有重要的保护作用，其中BDNF和GDNF是关键的NTFs。Tzameret 等[33]研究证实，给予RP的大鼠移植BMSCs 后可救援感光细胞，明显改善视功能。

3.4利用小分子触发器诱导产生GNDF间接神经保护是一种新兴的替代方法。随着对生长因子诱导和释放的日益了解，利用小分子物质诱导产生GDNF逐渐成为研究的热点。已证实GNDF可以被不同的小分子诱导[8]，如抗抑郁药[34]、丙戊酸钠[35]。

研究发现，丙戊酸钠的全身治疗营救了光感受器变性的rd10小鼠的部分光感受器[35]。但以前临床研究显示视力并没有提高[36]。Baranov等[37]观察了一种新型的小分子GSK812，在其浓度低于50 nmol·L-1时即可诱导产生GDNF，并发现无论是向健康的还是患病的小鼠的玻璃体腔内单次注射GSK812，其视网膜内的GDNF mRNA和蛋白质水平均上调。之后他们研发了一种可以持续释放的混悬液，向C57Bl/6小鼠的玻璃体内注射GSK812混悬液后，GDNF的mRNA水平(>1.8倍)及蛋白质水平(>2.8倍)均明显上调。GSK812引起rho-/-小鼠外核层光感受器细胞数目产生2倍的差异。在RCS大鼠中，GSK812的注射长期拯救了光感受器和外节段，并且保留了其功能。

4 问题与展望

GDNF治疗RP的新型给药方式提高了GDNF的生物利用度，给治疗RP带来了希望，但仍有许多问题尚待解决。首先应该考虑到动物与人体的差异性，比如干细胞介导GDNF的伦理问题等。其次，在给药方式上，局部给药仍造成一定的眼组织损伤，如何在不损伤眼组织的条件下，使GDNF维持以稳定的浓度靶向治疗RP将是一个研究方向，如通过全身给药，或者以滴眼液的方式给药。最后，如何调控GDNF的分泌和表达水平仍需进一步探讨与研究。相信随着对GDNF给药方式研究的不断深入，GDNF治疗RP将更加安全、高效、稳定。