连翘果实连翘酯苷提取及复配保鲜喷洒液应用研究

毛若冰，张晓虎，谢 倩，何 勇

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

连翘为木犀科连翘属植物连翘(Forsythiasuspense(Thunb.)Vahl)的干燥果实，产地集中在中国陕西、山东、河南、河北、四川等省份。商洛市位于陕西省东南部，地处秦岭山地，连翘资源丰富，是该市重点发展的“五大商药”之一[1]。连翘属性苦微寒，在我国民间药用历史悠久，作为中国传统中药，经常在临床上被使用，具有清热解毒、消肿散结等功效[2,3]。连翘具有广谱消炎抗菌作用，对金黄色葡萄球菌等致病菌的杀菌作用极强，对流感病毒和真菌也有一定的抵抗作用[4～6]。连翘主要成分有连翘酚、熊果酸、松脂素、齐墩果酸、白桦脂酸、黄酮醇甙类等。

连翘酯苷是连翘中的主要抗菌活性成分之一，能有效调节细胞因子发挥免疫作用，并且具有高效抗氧化功能[7,8]。连翘酯苷提取物作为一种天然防腐物质，对环境中常见腐败菌的繁殖有较强的抑制作用。邱智军等人[9]的研究结果表明连翘酯苷对油脂的抗氧化作用比连翘苷等其他活性组分更为显著。连翘酯苷可广泛应用于生鲜食品保鲜等方面，延长食品的保质期，有希望能够开发成为一种成本较低的并且安全环保的新型食品防腐产品[10]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 连翘果实(2017年9月采摘于陕西省商洛市商州区丹江公园)、成熟圣女果(2018年4月采摘于商州区佳骞现代农业园)、泡沫包装盒(一次性)、PE 保鲜膜(厚度0.11 mm)、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

1.1.2 试剂 连翘酯苷标品(购于陕西省西安晶博生物科技公司)、95%无水乙醇、80%甲醇(分析纯)、蒸馏水、氯化钙、柠檬酸、植酸(食品级)。

1.1.3 菌种 革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌。

1.1.4 仪器设备 数控超声波清洗器(KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司)、高速离心机(TG16-WS型，长沙湘智离心机仪器有限公司)、果实硬度计(GY-3型，上海精密仪器仪表有限公司)、电子天平(FA3204B型，上海精科实业有限公司)、电热鼓风干燥箱(DHG-9030A(101)型，上海齐欣科学仪器有限公司)、生化培养箱(LRH-70F，上海齐欣科学仪器有限公司)、多用粉碎机(HK-430型，杭州旭众机械设备有限公司)、紫外可见分光光度计(cary100/300型，深圳海瑞斯自动化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理 将采摘的连翘果实在电热鼓风干燥箱内105℃杀青30 min，80℃烘干至恒重，粉碎后过40目筛密封于干燥的广口瓶内，保存备用。

1.2.2 制备连翘酯苷标准曲线 准确称取连翘酯苷标准品5 mg，用蒸馏水定容至50 mL容量瓶内摇匀，得到0.1 mg·mL-1的连翘酯苷标准溶液。分别精确吸取0.1 mg·mL-1连翘酯苷标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL以80%甲醇定容于100 mL容量瓶内摇匀，分别得到0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg·mL-1浓度连翘酯苷标准溶液，以不加连翘酯苷的溶液作为对照。利用紫外分光光度计于波长266 nm处测不同浓度连翘酯苷标准溶液的吸光度，每个样品测定3组平行并取平均值。以连翘酯苷标准溶液浓度为横坐标，以所测吸光度为纵坐标，得到连翘酯苷标准曲线。

1.2.3 连翘果实连翘酯苷的提取及测定 精确称取0.5 g连翘果实粉末，按一定料液比加入不同浓度的乙醇溶液，并且控制提取时间和温度，选择一定的超声功率提取。提取完成后置于高速离心机在转速4 000 r·min-1下分离5 min，获上清液即连翘果实连翘酯苷的提取液。吸取连翘酯苷提取液1 mL，定容于10mL容量瓶内摇匀。然后吸取1.0 mL定容于25 mL容量瓶中，在266 nm处测定吸光度(若吸光度值不在连翘酯苷标准曲线范围内可进行稀释)，重复3次取平均值，结合回归方程计算连翘酯苷提取率。计算公式如下：

式中：W%—连翘果实连翘酯苷提取率%；C—连翘酯苷质量浓度(含量)mg·mL-1；n—稀释倍数；V—连翘酯苷提取液体积mL；M—连翘果实粉末质量mg。

1.2.4 单因素实验 分别探讨提取时间(20、30、40、50、60 min)、乙醇体积分数(40、50、60、70、80%)、提取温度(40、50、60、70、80℃)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、超声功率(100、150、200、250、300 W)五个因素对连翘果实连翘酯苷提取率的影响。

1.2.5 响应面实验设计 在单因素实验的基础上，以连翘果实连翘酯苷提取率为响应值，选取3个影响显著的因素，以单因素实验最适条件的数值为中心点，设计3因素3水平响应面实验，利用Design-Expert8.0.6软件对提取条件进行数学建模，得到最优工艺参数。

1.2.6 抑菌实验设计 分别取活化后的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌接入无菌水中，制备浓度为1×105 cfu·mL-1的菌悬液备用。将待试菌悬液各取0.1 mL加入到牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养皿中，涂布均匀。将连翘酯苷配制成100、50、25、12.5、6.25 mg·mL-1五个浓度梯度(每个浓度做3组平行)。将直径为6 mm的滤纸片120℃干热灭菌2 h后完全浸渍于各浓度提取液中，经干燥后放入含菌培养基表面中央，以无菌水为空白对照，37℃恒温培养24 h后取出观察，用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.2.7 保鲜喷洒液的筛选及保鲜实验设计 选用氯化钙、植酸、柠檬酸及连翘酯苷提取物作为防腐保鲜喷洒液配方的组分[11,12]，设计成4因素3水平的实验处理，见表1。

表1 保鲜喷洒液配方筛选实验设计

防腐保鲜效果实验设计：每组取新鲜成熟圣女果0.5 kg用喷洒液进行喷洒处理，置于一次性泡沫包装盒中，用保鲜膜密封，于温度25℃、湿度65%条件下贮藏，分别于2、4、6、8、10 d后观察测定相关指标，选择最佳组合，重复实验两次。测定项目与计算方法如下：

烂果率%=(腐烂圣女果个数/圣女果总个数)×100%；

失重率%=[(圣女果贮前质量—圣女果贮后质量) /圣女果贮前质量]×100%；

果实硬度测定方法：用果实硬度计对贮后圣女果进行硬度测定，每个样品测定三次取平均值。

2 结果与分析

2.1 连翘酯苷标准曲线

连翘酯苷标准曲线见图1，标准曲线回归方程Y=6.5003X+0.0068，R2=0.9986。

图1 连翘酯苷标准曲线

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 提取时间对连翘果实连翘酯苷提取率的影响 提取时间对连翘果实连翘酯苷提取率的影响见图2。表明随着时间的增加，连翘酯苷物质不断被提取，提取率增大；当时间为50 min时连翘酯苷提取率达到最高，为5.63%；时间超过50 min时，连翘酯苷细胞内温度升高及在空气中暴露时间延长发生降解或缩合等反应，提取率逐渐下降。因此50 min为较佳的提取时间。

图2 提取时间对连翘果实连翘酯苷提取率的影响

2.2.2 乙醇体积分数对连翘果实连翘酯苷提取率影响 乙醇体积分数对连翘果实连翘酯苷提取率影响见图3。表明乙醇体积分数由40%提高到60%时，连翘酯苷提取率逐渐增大；当乙醇体积分数为60%时，连翘酯苷提取率最高，为5.41%；当乙醇体积分数继续增大时，溶液极性增强，导致连翘酯苷溶解度降低，提取率减小。因此60%为较佳的乙醇体积分数。

图3 乙醇体积分数对连翘果实连翘酯苷提取率的影响

2.2.3 提取温度对连翘果实连翘酯苷提取率的影响 提取温度对连翘果实连翘酯苷提取率的影响见图4。表明温度增高时，分子运动速度加快，易于连翘酯苷溶出，提取率增大；温度为50℃时提取率最高，为5.39%；当提取温度继续增高，连翘酯苷受热降解，提取率降低。因此50℃为较佳的超声提取温度。

图4 提取温度对连翘果实连翘酯苷提取率的影响

2.2.4 料液比对连翘果实连翘酯苷提取率的影响 料液比对连翘果实连翘酯苷提取率的影响见图5，连翘果实连翘酯苷提取率随着料液比的增大先增后减，随着溶剂量的增大，溶解度增大，在较短时间内与大量溶剂充分反应；连翘酯苷提取率最高为5.61%；料液比主要影响传质推动力，大量的溶剂会影响提取体系的传质和传热，不利于提取的进行。因此1∶15为较佳的料液比。

图5 料液比对连翘果实连翘酯苷提取率的影响

2.2.5 超声功率对连翘果实连翘酯苷提取率的影响 超声功率对连翘果实连翘酯苷提取率的影响见图6。表明超声功率增大时，连翘酯苷提取率增加，原因是超声波的热效应、空化效应和机械作用，可以有效地破坏细胞壁，促使连翘酯苷快速大量溶出；功率为150 W时，提取率最高为5.56%；当超声功率继续增大时，超声波的热效应使连翘酯苷分解，提取率下降。因此150 W为较佳辅助功率。

2.3 响应面实验结果与分析

2.3.1 响应面因素及水平的确定 固定乙醇体积分数为60%，提取温度为50℃，选取对连翘果实连翘酯苷物质提取率影响较大的料液比、提取时间、超声功率3个因素，确定响应面因素水平。响应面实验因素及水平见表2。

图6 超声功率对连翘果实连翘酯苷提取率的影响

因素水平-101A料液比/(g∶mL)1∶101∶151∶20B提取时间/min405060C超声功率/W100150200

2.3.2 响应面实验方案与结果 以连翘果实连翘酯苷提取率为A、B、C三个因素的响应值，进行3因素3水平响应面对连翘果实连翘酯苷提取工艺进行优化实验。在17个实验组合条件下，实验设计与结果见表3。

表3 响应面实验方案与结果

2.3.3 回归分析 以A料液比，B提取时间，C超声功率为自变量，连翘果实连翘酯苷的提取率W为数学建模的响应值，利用软件对表4中的实验结果数据进行多元回归拟合[13]，得到二次多元回归方程模型为：

W=5.84+0.096*A+0.15*B-0.39*C+0.079*AB-0.27*AC-0.10*BC-0.64*A2-0.58*B2-0.72*C2

该方程中各项系数的正、负值反映了各因素对响应值的影响方向，绝对值大小反映影响程度[14]。从方程的一次项系数的绝对值大小，看出影响连翘酯苷提取率因素的顺序为：超声功率>提取时间>料液比。该方程式的二次项系数均为负值，可推断方程形成的抛物面开口向下，具有极大值点，能够进行优化分析[15]。回归模型系数的显著性检验结果见表4。

由表4可知，方程模型显著性P<0.0001，极显著，说明模型有意义。一次项中A、B、C和二次项A2、B2、C2对响应值影响均为显著，交互项AB、AC、BC对响应值的影响也为显著，说明交互作用对响应值影响较强。模型的失拟项P值仅为0.1411，说明拟合回归方程符合实际情况，模型能较好地反映真实实验值，可用此模型对连翘酯苷提取率进行分析和预测[14,15]。回归模型方差分析见表5。

表4 回归模型系数的显著性检验结果

表5 回归模型方差分析

由表5可知，相关系数R2=0.9998，校正系数R2Adj=0.9996，表明该回归模型可以解释99.96%的响应值变化，表明模型与实际情况拟合较好。变异系数C.V=0.29%，说明模型能较好地反映真实的实验值，优化提取工艺可以通过该方程来确定。

图7 超声时间和液料比的交互作用对连翘酯苷提取率影响的等高线

图8 超声时间和液料比交互作用对连翘酯苷提取率影响的响应曲面

2.3.4 响应面分析 由图7、图8可知，当料液比一定时，连翘酯苷提取率随着提取时间的增加而上升，当超声时间在48～54 min时，连翘酯苷提取率达到最大，随着时间的延长，连翘酯苷提取率逐渐下降；当提取时间一定时，随着料液比的增加，连翘酯苷提取率先上升后降低，约在料液比为1∶14～1∶16 g·mL-1时，连翘酯苷提取率达到最大。结果表明，超声时间、料液比二者的交互影响对连翘酯苷提取率的影响较小。由此可知，合适的料液比对获得较高的连翘酯苷提取率较为重要。

图9 超声功率和液料比交互作用对连翘酯苷提取率影响的等高线

由图9、图10可知，当超声功率一定时，料液比在1∶14～1∶16 g·mL-1时，连翘酯苷提取率逐渐增加，之后随着料液比的增加提取率逐渐下降；当料液比一定时，可得到较高连翘酯苷提取率的超声功率为125～175 W，之后连翘酯苷提取率会随超声功率的提高而降低。由此可知，合适的超声功率和料液比对连翘酯苷提取率均比较重要[16]。

由图11、图12可知，当提取时间一定时，超声功率125～175 W左右连翘酯苷提取率较高；当超声功率一定时，提取时间在45～55 min时，连翘酯苷提取率较高。因此可知，在实验水平范围内，延长提取时间在适宜的超声功率下可获得较高的连翘酯苷提取率。

2.4 抑菌实验结果分析

图10 超声功率和液料比交互作用对连翘酯苷提取率影响的响应曲面

图11 超声功率和超声时间交互作用对连翘酯苷提取率影响的等高线

图12 超声功率和超声时间的交互作用对连翘酯苷提取率影响的响应曲面

供试菌种不同浓度提取物的抑菌圈直径/mm100/(mg·mL-1)50/(mg·mL-1)25/(mg·mL-1)12.5/(mg·mL-1)6.25/(mg·mL-1)0/(mg·mL-1)〛金黄色葡萄球菌17.812.68.16.34.70枯草芽孢杆菌15.110.36.84.74.10大肠埃希氏菌14.39.15.44.63.40

由表6可知，连翘酯苷提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌均有抑制效果，抑菌效果为金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌>大肠埃希氏菌，浓度为100 mg·mL-1的连翘酯苷提取物对金黄色葡萄球菌最大抑菌直径为17.8 mm。

2.5 最佳复配保鲜喷洒液的筛选及保鲜实验结果分析

由表7可见，在常温下随着时间的增加，不同配方组合的喷洒液处理的圣女果烂果率均为上升趋势。结果表明：观察期内(10 d)第3配方组合处理的圣女果烂果率最低仅为26.79%。

由表8可见，随着时间的增加，不同配方组合的喷洒液处理的圣女果失重率均呈现上升趋势。结果表明：保藏期内(10 d)第3配方组合处理的圣女果失重率最低仅为2.96%。

由表9可见，在常温下随着时间的增加，不同配方组合的喷洒液处理的圣女果硬度均为下降趋势。结果表明：保藏实验期内(10 d)第3配方组合处理的圣女果硬度最大约为0.68 mg·cm2。

表7 不同配方组合对圣女果烂果率的影响结果 (%)

表8 不同配方组合对圣女果失重率的影响结果 (%)

表9 不同配方组合对圣女果硬度的影响结果 (mg·cm2)

3 结论与讨论

3.1 结论

(1)响应面实验得到的优化提取条件为：提取时间50 min、超声功率150 W、超声温度50℃、乙醇体积分数60%、料液比1∶15。影响连翘果实连翘酯苷提取率的顺序为：超声功率>提取时间>料液比。

(2)抑菌效果为：金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌>大肠埃希氏菌，浓度为100 mg·mL-1的连翘酯苷提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为17.8 mm。

(3)最佳连翘酯苷复配保鲜喷洒液配方为：2%连翘酯苷提取物+1%氯化钙+0.15%植酸+2%柠檬酸，对圣女果保鲜效果良好，并可适当延长保藏时间。

3.2 讨论

(1)张晓虎等[10]研究表明甲醇浸提连翘酯苷的提取率最高为6.668%，乙醇浸提连翘酯苷的提取率最高为5.916%。连翘果实的最佳采摘期一般在8月份左右，连翘酯苷含量较高，采摘过早或过晚连翘酯苷含量都会有所降低。笔者用乙醇为提取溶剂的原因是实验以圣女果为保鲜应用对象，而甲醇具有毒性不宜采用。

(2)笔者采用超声辅助乙醇提取连翘果实中的连翘酯苷，利用超声波产生的空化效应、机械作用和热效应加速溶剂进入固体物质，从而快速提取目标物质。与其他溶剂提取法比较，超声辅助提取不但可以节省时间和减少能耗，而且避免高温影响有效成分。

(3)响应面法通过分析实验值，建立比较符合实际情况的模型，相比其他方法可以更加直观准确地进行数据分析，方便优化工艺条件，得到较为精确的最优工艺参数，可节约生产成本[14,15]。

(4)商洛地区连翘资源丰富，亟待综合开发利用，连翘酯苷提取物能有效抑制环境中常见腐败菌的繁殖，可作为天然防腐成分延长食品的保质期，极具潜力开发成为新型食品防腐剂。