响应面法优化重楼药材中甾体皂苷的回流提取工艺研究

王仕宝，苏 莹，李会宁，杨培君 ，吴 鹏

(1.汉中职业技术学院，陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001)

中药材重楼为百合科重楼属(Paris)植物的泛称，主要分布于我国云贵地区、四川南部及西藏南部等地。重楼为稀有药材，具有抗肿瘤、消肿止痛、止血、抗菌消炎和免疫调节等作用，对治疗癌症、毒蛇咬伤、跌打损伤、咽喉肿痛和惊风抽搐等方面有显著疗效[1～2]。重楼属我国产23种12变种，目前药材市场重楼品种混乱，2015年版《中国药典》收载的重楼(Rhizoma Paridis)为百合科重楼属植物云南重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Franch.) Hand-Maz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.) Hara的干燥根茎[3]。有文献报道[4～7]，重楼皂苷含量高低与重楼药材的干燥方式及不同提取方法有一定的关系。

因此，笔者实验首先通过比较回流提取、超声提取及微波辅助提取方法对重楼皂苷粗品提取率的影响，结果发现回流提取皂苷量较多，方法简单可行，故试验选择回流提取法进行操作。由于影响重楼皂苷提取分离的因素较多，所以在单因素实验的基础上，参照相关文献[8～9]采用响应面软件Design Expert 8.0的设计方法，以影响重楼皂苷类提取纯化工艺的4个显著因素(液料比、提取溶剂、提取时间、提取次数)为自变量，重楼皂苷类得率(Y)为响应值，进行响应面分析筛选了最优化的甾体皂苷类化合物提取工艺，从而为重楼药材资源开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与材料

1.1.1 试验仪器 高效液相色谱仪(E2695，美国 Waters公司)，超声清洗器(KQ3200DB，江苏昆山超声仪器有限公司)；优普超纯水机(UPH-40，成都超纯科技有限公司)，电子天平(MS105DU，d=0.01mg，梅特勒-托里多)；循环真空泵(SKD-Ш，郑州长城科工贸有限公司)；旋转蒸发仪(RV10，德国IKA公司)；粉碎机(HL-500A型高速多功能粉碎机)等。

1.1.2 试药与材料 对照品包括重楼皂苷Ⅰ(HN1116XB13)、重楼皂苷Ⅱ(R22O6F4766)、重楼皂苷Ⅵ(RN1118FA13)、重楼皂苷Ⅶ(111593-200402)、重楼皂苷H(P22J7F9421)、重楼皂苷V(P22J7F9420)和薯蓣皂苷(CA0816CA14)均购于上海源叶生物科技有限公司(所有对照品纯度HPLC≥98%), 乙腈为色谱纯(天津光复精细化工研究所)，甲醇为色谱纯(天津科密欧化学试剂有限公司)，乙醇等试剂均为分析纯，水为超纯水。供试样品于2015年8月采集于陕西省汉中市镇巴县简池镇，经陕西理工大学生物科学与工程学院杨培君教授鉴定为七叶一枝花Parispolyphyllavar.chinensis(Franch.) Hara的根茎。从所采药材中选取大小适中的根茎作为供试材料，于50℃干燥，粉碎，过粒径0.45mm筛，备用。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 Inertsil ODS-3C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温35 ℃，分析时间16 min，进样量20 μL，流动相为乙腈-水(50∶50)，检测波长为203 nm，流速为1.0 mL·min-1。在该条件下，对照品与样品的色谱图，见图1。

1.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取105℃干燥至恒质量的重楼皂苷对照品适量，用甲醇定容于容量瓶中，使重楼皂苷Ⅶ、H、Ⅵ、Ⅱ、薯蓣皂苷、Ⅰ 和V的终质量浓度分别为184，192，184，256，174，184和188μg·mL-1的对照品混合溶液，存于4℃冰箱中供分析使用。

1.2.3 供试品溶液的制备 取经干燥的重楼供试样品，精密称定2.0 g粉末，置圆底烧瓶中，精确加入乙醇50.0 mL，称定质量，回流提取30 min，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，静置10 min。取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液，存于4℃冰箱中供分析使用。

图1 HPLC图

1.2.4 HPLC标准曲线的建立 依次精密量取混合对照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，分别移至10mL量瓶中，加甲醇定容，然后用0.22μm滤膜过滤，依次进样20.0μL进行色谱分析，测定峰面积。分别以各色谱峰面积(Y)为纵坐标，以对照品质量浓度(X)为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线。保留时间、线性回归方程、相关系数和线性范围(表1)。

表1 重楼对照品回归方程及相关系数

1.3 单因素实验

笔者实验首先通过比较回流提取、超声提取及微波辅助提取方法对重楼皂苷粗品提取率的影响，结果发现回流提取皂苷量较多，方法简单可行，故本试验选择回流提取法进行操作。由于影响重楼皂苷提取分离的因素很多，所以实验分别对提取溶剂、液料比、提取时间、提取次数四个因素对重楼皂苷得率的影响进行逐个考察。

1.3.1 提取溶剂 在参照文献[10]的基础上，固定液料比30∶1(mL∶g)，水浴提取温度(85℃)，提取时间(60 min·次-1)及提取次数(1次)，分别在下列提取溶剂中提取并进行重楼皂苷得率检测。试验结果表明，选择70%乙醇作为提取溶剂效果较好(表2)。

表2 提取溶剂对皂苷得率的影响

1.3.2 提取前浸泡时间 固定提取溶剂(70%乙醇)，固定液料比30∶1(mL∶g)，水浴提取温度(85℃)，提取时间(60 min·次-1)及提取次数(1次)，分别考察在溶剂中冷浸时间为30，60，90，120和150 min的提取效果。结果表明，选择浸泡时间为90 min较为适宜(图2)。

1.3.3 液料比 固定提取溶剂(70%乙醇)，其它条件同(1)项，考察液料比为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1(mL∶g)对重楼皂苷得率的影响。结果表明，选择液料比为40∶1(mL∶g)，效果最佳(图3)。

图2 浸泡时间对得率的影响

图3 液料比对得率的影响

1.3.4 提取时间 固定液料比为40∶1(mL∶g)，其它条件同(1)项，分别考察提取时间为30，45，60，75和90 min·次-1对重楼皂苷的影响。结果表明，选择提取时间60 ·次-1为最佳(图4)。

图4 提取时间对得率的影响

1.3.5 提取次数 固定提取溶剂(70%乙醇)，固定液料比40∶1(mL∶g)，水浴提取温度(85℃)，提取时间(60 min·次-1)，分别考察提取次数为1，2，3和4次对重楼皂苷得率的影响。结果显示，选择提取次数为2时最佳(图5)。

图5 提取次数对得率的影响

2 响应面法设计

2.1 响应面法设计与结果分析

根据上述单因素试验结果，采用响应面软件Design Expert 8.0设计方法，以影响重楼皂苷类提取纯化工艺的4个显著因素(液料比、提取溶剂、提取时间、提取次数)为自变量，重楼皂苷类得率(Y)为响应值，进行响应面分析。因素与水平设计见表3。结果见表4和表5。

表3 因素与水平

通过软件Design Expert 8.0，对表4中数据进行多元回归拟合分析，可得到重楼皂苷得率与主要因素间的关系方程为：

Y=-2.200+0.057A+1.966B+0.560C+0.030D-1.250E-003AB+3.7503E-004AC+1.500E-004AD-0.030BC-0.011BD+7.500E-003CD-4.431E-004A2-1.029E-004B2-0.169C2-1.085E-003D2。

在试验设计范围内，一次项的偏回归系数的绝对值B> C > A> D，说明提取时间对皂苷得率影响最大，其次是提取次数和溶剂浓度，液料比对皂苷提取率的影响最小。

重楼皂苷得率与主要影响因素之间关系模型后进行方差分析，结果见表5。

表4 响应面分析方案及试验结果

由表2～表5可知，该模型(F=91.02，p<0.0001)极其显著，模型中失拟项(F=3.69，p=0.1100>0.05)不显著。上述结果表明，该模型设计合理，实验方案恰当，具有一定的可操作性。

表5 模型的方差分析与显著性检验结果

注：p值小于0.01为非常显著；p值小于0.05为显著；p值大于0.05为不显著。

2.2 响应面交互作用分析

在回归方程中，交互项AD、BD、CD均有较高的显著性，此充分表明溶剂浓度、提取时间和提取次数的交互作用对重楼皂苷类得率有较显著影响。在二次回归模型方程基础上，通过响应面绘图，依次得到比较显著的三维图和等高线图，图6～图8所示。其中AD、BD、CD 3个等高线图呈椭圆形，说明两因素间交互作用较强，结果影响显著。

图6显示，响应曲面的坡度比较陡峭，表明响应值的(重楼皂苷类得率)大小对溶剂百分比和液料比的改变较为敏感。当溶剂百分比为70%，液料比30∶1(mL∶g)时，重楼皂苷类的得率达到最大值。从等高线可以看出，溶剂百分比的变化对重楼皂苷类得率的影响，相比液料比变化对皂苷类得率的影响大。

图7显示，响应曲面的坡度相对较为陡峭，表明响应值(重楼皂苷类得率)对提取时间和液料比的改变较为敏感。随着提取时间和液料比的增加皂苷类得率呈相应增加的趋势，提取时间为60 min，液料比为30∶1(mL∶g)时，重楼皂苷类得率达到最大值。从等高线可看出，提取时间的变化对重楼皂苷类得率的影响，相比液料比变化对皂苷类得率的影响大。

图8显示，响应曲面的坡度相对陡峭，表明响应值(重楼皂苷类得率)对提取次数和液料比的改变甚为敏感。当提取次数为2次，液料比为30∶1(mL∶g) 时，重楼皂苷类得率达到最大值。从等高线可以看出，提取次数的变化对重楼皂苷类得率的影响，相比液料比变化的影响大。

图6 溶剂百分比和液料比交互影响3D分析

图7 提取时间和液料比交互影响3D分析

图8 提取次数和液料比交互影响3D分析

2.3 最佳工艺验证

综上所述，采用Design Expert 8.0软件计算与分析所得，各因素的最优条件确定为：提取溶剂70%乙醇，提取前浸泡时间为90 min，液料比30∶1(mL∶g)，提取时间60 min·次-1及连续提取2次。在最佳条件下，重楼皂苷类得率的软件预测值为2.155%。为检测响应面法所得结果可靠性，采用上述优化条件进行重复试验，得实际提取率值为2.094%。与预测值相比，其相对偏差值为2.83%。因此，基于上述回归方程可对重楼皂苷实际提取过程进行预测和控制。

3 结论

由于产区、采收季节不同或种类不同，导致皂苷成分的类别和含量存在差异。笔者曾对15批不同来源重楼样品基于HPLC测定了7种甾体皂苷的含量，同时构建了重楼药材的HPLC指纹图谱，其实验结果可用于重楼的真伪鉴别和质量评价[11]。此外，炮制手段和制备方法不同，也会影响重楼的品质和药效。因此，开展重楼品质分析与质量监控，探讨重楼有效成分的提取分离工艺，构建重楼分析检测方法等相关研究具有重要意义。目前，对中药重楼的皂苷类化学成分的提取分离研究，文献报导较多，包括回流提取法、超声提取法、植物酶提取法、微波辅助提取、超临界流体萃取(SFE)等[12～16]。其中，前两种皂苷的提取方法多被采用。卢伟等[17]研究了回流法对重楼皂苷的提取工艺；当乙醇浓度为90%、液料比为12∶1、提取时间1 h·次-1，连续提取2次为重楼总皂苷的最佳提取工艺。笔者研究通过比较回流提取、超声提取及微波辅助提取等多种方法对重楼皂苷粗品提取率的影响，结果发现将重楼根茎切片在50℃烘箱中干燥，粉碎，过粒径0.45 mm筛子后，以70%乙醇回流提取效果较好。由于影响重楼皂苷的提取纯化因素很多，所以实验考察了提取溶剂、液料比、提取时间、提取次数4个因素对重楼皂苷得率的影响；通过响应面法设计，以7种重楼皂苷之和为考察指标，优化了重楼皂苷的提取工艺过程，最终确定以70%乙醇为提取溶剂、液料比为40∶1(mL∶g)、浸泡90 min、提取时间60 min·次-1及连续提取2次最佳。按照最佳提取工艺，皂苷的实际测定值与预测值基本一致。