组织工程支架在骨软骨修复中的应用进展

马 钢，肖云峰，刘晓民※，丁良甲，刘长路，高 博

(1.内蒙古医科大学第二附属医院关节外科，呼和浩特 010030； 2.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心，呼和浩特 010100)

创伤或退行性疾病引起的骨软骨组织损伤很难再生。目前临床常用的多种治疗手段能够有效缓解骨软骨损伤带来的病痛，但仍存在很多弊端[1]，组织工程技术的兴起为这些问题的解决带来了希望。在骨软骨修复过程中，为获得满意的细胞附着功能和最佳的生物活性分子的治疗作用，首先需要考虑的因素是支架的设计与性能。能够用作支架的材料首先应具有组织相容性、生物可降解性、机械稳定性以及多孔隙结构等；支架可以被制备为多种类型如水凝胶、多孔泡沫、纤维网络等；同时，支架还应有利于细胞黏附、迁移、生长、分化，从而益于新生骨软骨形成。因此，利用合适的材料、先进的制备技术以及可调控的信号分子仿生双相功能性支架，可以有效帮助解决骨软骨损伤后修复与再生的难题，为骨软骨损伤后的修复再生治疗提供希望。

1 支架的性能和结构

1.1生物相容性及可降解性材料的选择 生物材料制作的支架不能引起宿主免疫反应或异物反应，需符合宿主体内组织的增长速率。支架材料的来源有天然聚合物、人工合成聚合物、金属材料、无机材料以及复合材料。天然或合成的聚合物柔韧性较佳，可塑形成理想的形状。天然聚合物富含对细胞有益的分子，如糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAG)、胶原、 类GAG、 丝素蛋白等，这些天然聚合物易被复合入支架中，从而改善支架与宿主组织的生物亲和力[2-3]。聚合明胶藻酸钙支架具有改善细胞黏附、增殖以及促进骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化形成软骨及成骨细胞的潜能[4]。天然聚合物在细胞相容性与生物活性方面普遍优于合成聚合物，但在机械性能和可降解性方面相对较弱。可生物降解的合成聚合物(如脂肪族聚酯)已被用于骨软骨支架材料。根据合成条件，较易调控支架的机械性能。合成聚合物具有较差的表面活性与细胞亲和力，为改善这些性能，可采用复合以及共聚作用合成不同的聚合物，如聚乙烯醇复合聚己酸内酯(polycaprolactone，PCL)纳米纤维支架，其可以改善原有支架的生物兼容性与拉伸性能。与单纯PCL支架相比，复合PCL纳米纤维支架能够增强MSCs细胞增殖与软骨细胞分化能力[5]。但复合不同聚合物的支架仍不足够维持来自关节运动产生的机械应力和生物降解，在这些聚合物中加入无机离子可以改善机械性能，如加入金属和陶瓷，形成生物活性玻璃。少量的金属材料(如钛、钴及其合金成分)有利于改善支架的机械负载能力，使支架在软骨区域变得更柔软。在修复骨软骨缺损中，双相钛结合聚乙二醇水凝胶支架，可以较好地与邻近组织整合[6]。组织工程中的金属材料缺乏生物降解性，可造成组织磨损或腐蚀[7]。因此，将金属材料复合到骨软骨支架时必须小心。已知的生物活性陶瓷(如钙磷酸盐或生物活性玻璃)具有生物兼容性和生物降解性，已被广泛用于骨软骨支架，特别是在改善生物矿化方面的作用有利于骨形成，但同时也增大了脆性，因此与可生物降解的聚合物复合较普遍。由琼脂糖水凝胶/复合聚乳酸-羟基乙酸(polylactide-co-glycolide acid，PLGA)/生物活性玻璃材料复合组成的支架改善了支架的矿化作用，提高了骨软骨修复的整合能力[8]。生物活性陶瓷材料自身的脆性可为骨形成提供良好的硬度。

1.2支架的机械性能 深入了解骨软骨组织的机械性能有助于骨软骨支架的设计。根据关节软骨表面到软骨下骨的纤维走向、细胞形态与密度、GAG及胶原含量、含水量等生物学差异及相应的力学梯度差异，可将关节骨软骨分为浅表层、中间层(过渡层)、深层(辐射层)、钙化层、软骨下骨层。透明软骨层与钙化层交界处有一潮线结构，其将相对较软的关节软骨组织与相对坚硬的钙化软骨连接在一起,有抵抗剪切力、分散横向应力、紧密连接骨软骨以及限制组织液在骨软骨界面自由交换等作用[9]。钙化层下方为软骨下骨平台，两层交错结合锚定，形成黏合线[10]。骨软骨组织每一层都有不同的机械强度。骨软骨组织不匹配的黏弹性可导致软骨组织间压力分布不均。表面软骨能够承受局部压力为0.8～2 MPa，拉伸模量为5～25 MPa，平衡剪切模量为0.05～0.25 MPa[11]。这些差异源自组成软骨的生物和化学成分在各层结构分布的不同。

为实现骨软骨组织的最佳抵抗力，表面的胶原蛋白平行于剪切方向，而中间层、深层的胶原蛋白垂直于表面。从浅表层到深层，Ⅱ型胶原和含水量呈递减趋势，Ⅰ型胶原与GAG含量呈递增趋势。由于中间层GAG含量较高，组织的渗透率也低于浅表层。因此，中间层可适度调节和缓冲来自关节的压应力[12]。利用转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和机械刺激可以加快软骨组织重塑的进程，并使其拉伸模量高达3.4 MPa[13-14]，但这还远小于天然组织的拉伸模量值。骨软骨组织就像一个无摩擦轴承，将负载转移到骨骼以防止局部应力过大。支架能否与周围组织良好整合以及如何保持植入物的机械稳定性是制造低摩擦表面支架的关键问题。软骨的润滑特性来源于挤压膜润滑的复杂组合方式，包括弹性流体力学润滑、边界润滑方式、间质液增压、迁移接触面润滑等[11]。若无软骨的摩擦系数(摩擦系数：0.005～0.02)，接触剪切将引起巨大的磨损[15]。由聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷酮水凝胶组成的低摩擦软骨支架具有良好的生物兼容性与负重性能[16]，但机械性能与天然软骨组织接近的支架目前还尚未报道。

1.3支架的孔隙结构 在大部分支架中，孔隙结构会影响细胞应答，调节细胞侵袭、血管生成、组织再生等过程。支架的多孔结构的形成主要依赖于制造过程。传统制备方法包括纤维粘接法、溶剂浇铸/粒子沥滤法、发泡法、相位分离法等[17]。使用这些技术加工的多孔支架具有适合组织工程使用的可控的孔径大小及孔隙率。天然骨具备50%～90%的多孔环境，孔隙直径通常为1 mm[18-19]。有学者认为，大于50%的多孔环境以及孔隙直径为300 μm的支架结构能够增强骨和血管的生成[20]。90～120 μm的孔隙有利于MSCs增殖形成软骨组织[21]。

1.4支架的双相结构及界面整合能力 多相支架能够提供利于细胞间、细胞与基质间信号交流的最佳环境[22]。同时，整合材料能够将软骨层的物理或化学成分转移至骨层。支架内细胞间的交互作用使得骨软骨支架中软骨与骨相界面的整合成为可能。事实上，双相梯度的负载细胞支架在植入手术后较非细胞支架具备更强的骨软骨形成能力[23]。因此，具有双相梯度的负载同源或异源细胞的骨软骨支架经过改进，已具有较好的机械稳定性与整合能力。Yunos等[24]报道，通过分散同源单细胞进入双相的数量,可以考察由静电纺丝聚乳酸纤维作为软骨相及聚乳酸包被生物活性玻璃支架作为骨相的双相支架的界面整合能力。同样，由负载琼脂糖水凝胶的软骨细胞及负载微球复合生物活性玻璃的成骨细胞组成的异源细胞的双相支架也已经开发[8]。双相支架内部细胞相互接触避免各层间的分层现象，利于改善机械稳定性。

2 支架的设计

2.1纤维支架 纤维支架，特别是纳米纤维支架，在骨软骨组织修复方面拥有巨大潜能。纳米纤维形态很容易通过静电纺丝技术实现[25]，即在强大电场环境下，聚合物溶液通过注射针注入纤维内部，形成纳米纤维状支架。这种结构可促进细胞黏附，引导生长以及组织特异性分化[26]，并凭借可调节工艺，实现梯度合成，调整纤维比例以及小孔几何结构。当纳米纤维结构与超细纤维结合时，细胞接种效率与3D网格化效果将被改善。与附着于纳米纤维状微孔支架的MSCs比较，附着于粉末状纤维大孔支架上的MSCs分化能力更强[27]。虽然纳米纤维材料支架具备卓越的MSCs附着能力，但细胞浸润却受到限制。以上文献讨论的支架孔径绝大部分<30 μm，因此不适用于根据孔径尺寸评价骨软骨组织的再生能力。

许多学者已经对静电纺丝骨软骨支架的最佳孔隙结构展开研究。Zhang等[28]报道，50～300 μm孔径对由胶原和静电纺丝聚乳酸纳米纤维组成的双相支架有有利影响。孔径<300 μm的传统静电纺丝纤维支架可能妨碍成骨，因此在骨软骨修复过程中制备孔径>300 μm纤维双相支架对于骨生成是非常必要的。为了生产更大孔径的支架，有学者利用飞秒脉冲激光加工技术生产出孔径达500 μm的支架[29]。结合盐浸法制备静电纺丝纤维支架虽然增加了孔径，但也降低了支架的机械稳定性[25]。

快速成型技术通过计算机辅助制造系统与分层处理技术高度精确控制孔隙的几何形状，可以很容易地制造出界限明显的3D互连孔隙结构，同时具备适当的机械性能与生化特性[30]。Hutmacher[31]开发了一种熔融沉积模型技术制造用于骨组织工程的高孔隙度的PCL支架。这种基于计算机引导的3D绘图技术通过加热的喷嘴与滚筒提供预成型纤维。作为改良的熔融沉积模型技术，Woodfield等[32]发明了3D纤维沉积技术用来制备具有互通孔隙通道及高孔隙度(415 μm)的骨软骨支架，由3D纤维沉积技术制备的支架平均连接孔径增加到1 650 μm[33]。据推测，拥有这样孔径结构的支架非常适合骨软骨组织工程。此外，Bian等[34]发明了一种光刻与凝胶浇筑相结合的技术以制备纤维双相支架，支架由磷酸三钙与Ⅰ型胶原构成。这种纤维双相支架的骨相内部孔径大小为700～900 μm，孔隙率为50%～65%，两相间锚定结合的特别紧密，仿生出过渡结构[34]。

2.2水凝胶支架 水凝胶是由大量水填充的亲水聚合物网络组成，是3D凝胶状的天然细胞外基质(extracellular matrix,ECM)仿生物，被广泛用作支架材料。水凝胶支架具备完整的结构与稳定的机械性能，利于组织结构成型[35]，还能够以可控的方式结合输送的药物及生长因子。因具备以上优点，Ⅰ型胶原蛋白、明胶、GAG等黏弹性水凝胶被用于修复不规则的软骨损伤。水凝胶的单相成分不足以模拟骨软骨界面组织的复杂结构，其较差的机械稳定性也不足以承载界面组织的多种运动[36]。尽管水凝胶在某种程度上增加了细胞的迁移活性以及营养物质向细胞转递的能力，但受水凝胶理化特性与单相成分引导的细胞行为与应答明显不如典型的多孔支架指导的细胞行为与应答。可将黏弹性水凝胶制备成微球作为运载工具控释生长因子，进而修复骨软骨组织。无论是在体内还是体外，支架能释放生长因子，但含有微球体孔隙结构的支架，其机械稳定性仍未达到骨软骨组织的需要。杂交无机离子的双相水凝胶支架可以增加支架的机械稳定性。水凝胶双相支架的梯度无机成分在ECM合成与细胞表型中具有诱导骨软骨样转化的能力。Munoz-Pinto等[37]报道，采用光刻法制备双相钛结合聚乙二醇水凝胶水凝胶交联梯度聚二甲基硅氧烷支架发现，随着梯度无机成分的增加，ECM合成硫酸软骨素和Ⅱ型胶原蛋白增加，软骨细胞分化相关转录因子sox9的水平升高，支架的机械稳定性增加，但却观察到成骨细胞向软骨细胞样细胞转分化的现象。虽然基于水凝胶开发的双相支架经过许多尝试已取得成功，但由于水凝胶的微弱剪切力，双相界面的稳定性仍然较差。

2.3支架输送信号分子 信号分子包含生长因子、治疗药物以及基因。骨软骨组织工程充分利用信号分子的传送策略促进细胞生长与组织形成。这些策略促进了智能双相支架在骨软骨组织工程中的发展。信号分子通过诱导作用影响骨软骨组织中ECM的形成，同时刺激细胞连续不断地分泌蛋白以保证细胞生长的舒适环境。在支架设计时首先要信号分子的释放时效和剂量控制。

在骨软骨修复的信号分子中，纤维母细胞生长因子、TGF-β在成软骨细胞培养条件下能够增强ECM形成，而骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)能诱导成骨细胞生成[38]。BMP-2与聚多巴胺结合涂覆在支架上可改善支架材料的细胞附着力；用于修复骨缺损时，BMP-2可以在骨缺损区域发挥长期调节作用，表现出优异的生物活性[39]。将血管内皮生长因子和BMPs加载到明胶/PLGA纳米复合支架中可使生长因子在修复骨软骨缺损时持续释放，促进骨髓MSCs在支架上的黏附、增殖以及分化[40]。虽然生长因子对骨软骨修复有影响，但这种影响受生长因子释放时间的影响。要想获得更可持续、更可控的释放，需要精细设计支架，将信号分子包封入微球表面或内部，随后进入双相支架中[41]。微球既可作为支架又可作为载体，是可以负载多种信号分子用于组织工程修复骨软骨缺损的良好模型。

精确控制多种生长因子的时空释放动力学有利于受损组织的愈合[42]。序贯生长因子递送系统是指从不同理化性质的双分子层基质释放不同范围的生长因子[43]。当微球复合入支架后，不同降解速率的两种类型的微球被用来递送两种功能不同的生长因子[44]。Wang等[45]将一种双载体系统，即负载利于骨生成的BMP-2和利于软骨生成的胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)，引入多孔聚合物支架中。两种生长因子被负载于PLGA/纺丝微球表面，发挥持续释放BMP-2的作用，但IGF-1的释放受到限制。尽管PLGA/纺丝微球MSCs的软骨形成效率不高，但这套系统提供了通过时空控制实现生长因子共同递送的新思路。

骨软骨修复的基因递送技术如非病毒阳离子聚合物或脂质体已经被广泛用于提高基因转染效率的运载体的研究中。如纤维母细胞生长因子2和(或)IGF-1脂质内源性基因递送系统，成功实现培养基因修饰的软骨细胞向骨软骨支架的研制[46]。近年来，基因递送系统已经被进一步发展，将载体固定于支架基质表面，通过特殊靶基因有效地控制细胞分化。Chen等[47]报道，将分别编码TGF-β1与BMP-2的两种质粒固定于双相支架上的MSCs中，用于区别软骨生成与骨生成。MSCs在双相支架中壳聚糖-明胶层具有良好的软骨向分化能力，在羟基碳酸盐磷灰石层具有良好的骨向分化能力。

3 小 结

理论上，骨软骨支架需要多相结构去仿生天然的骨软骨分层结构，但多相结构太过复杂，不易控制各相的释放速度。双相支架分为软骨相和骨相，较多相支架简单，是界定界面组织的最佳骨软骨支架之一。尽管如此，双相支架的两相间仍存在机械稳定性的问题。采用一步法制备双相支架可以有效消除支架内部两相间的剪切力。但双相支架各相内骨及软骨生成的能力仍然不尽如人意，这也许是各相内细胞不能充分向骨或软骨分化生长，不能充分释放信号分子的原因。为克服这一问题，需要建立一个时空定位递送系统。利用这个系统，体外培养每个相内各自的细胞，以便充分识别特异的信号分子，有益于各个组织的再生。因此，在不久的将来充分利用双相支架时空靶向递送系统可以有效抵消两相间的剪切力，解决支架生物降解的难题。