生殖支原体耐药及机制研究进展

程灿灿，古裕莲

(广州市番禺区中心医院检验科，广州 511400)

生殖支原体是目前发现能独立复制的最小的原核细胞生物。在其发现的最初十几年内都少有关注，这与其生长缓慢，培养要求严格不无关系。然而随着技术的进步，尤其是聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术的应用，生殖支原体在性传播疾病中的致病作用逐渐得到重视。由于分子诊断学在临床及科研中的广泛应用，生殖支原体被证实是男性非淋球菌性尿道炎(non-gonococcal urethritis，NGU)的独立致病菌之一[1]，也被认为可引起女性的宫颈炎、子宫内膜炎及盆腔炎等疾病[2]，严重影响人们的泌尿生殖健康。生殖支原体主要通过生殖道黏膜接触传播，也有研究发现生殖道-肛门接触同样可以进行传播[1]。国外的研究发现，生殖支原体的感染或携带多发生在25岁以后[3]。各国学者对生殖支原体在NGU男性中的患病率进行了很多调查，发现在NGU患者中生殖支原体感染率较高，在复发性、沙眼衣原体阴性的NGU患者中生殖支原体感染率甚至更高。目前，核酸检测是诊断这种病原体感染的最主要手段。生殖支原体具有支原体类的无细胞壁的共性，在治疗上对抑制细胞壁生长的抗生素无效，只能选择干扰蛋白质合成或干扰DNA复制的抗生素。临床上用于治疗生殖支原体感染的有大环内酯类(代表药物阿奇霉素)、喹诺酮类(代表药物莫西沙星)、四环素类(代表药物多西环素)和链阳性菌素类(代表药物普那霉素)抗生素。不同于其他支原体的是，生殖支原体体外纯培养比其他支原体难度大，体外药物敏感性试验更是耗时长且缺乏标准。针对这类感染，临床上通常进行经验性用药治疗。这也可能是生殖支原体感染的治疗效果不好且耐药现象渐增的一大原因。现对生殖支原体的耐药性监测、目前的耐药现状及机制进行综述。

1 生殖支原体耐药性监测

由于生殖支原体对营养要求苛刻，生长极其缓慢，从临床标本中分离出的生殖支原体很难在无细胞培养基上生长。研究表明，应用尿道拭子标本，单纯的SP4培养基初代分离培养时间为1～3个月，Vero细胞培养法大约为3周[4-5]。这也给生殖支原体的体外药物敏感性检测带来困难，至今尚未有公认的标准方法来评价临床标本中生殖支原体的药物敏感性，现有的报道多数都是参考其他已有标准的支原体进行研究。目前体外药物敏感性检测方法主要有3种：琼脂稀释法、肉汤稀释法和细胞培养法。

1.1琼脂稀释法 早在1989年，Hannan[6]就已经研究了生殖支原体在内的多种支原体琼脂稀释法药物敏感性检测，并在关于支原体属(兽医)最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)值检测的推荐和指南上做了改进和详细介绍。与传统的平板稀释法相似，菌液被接种在含有一系列抗生素(浓度差为2倍)的琼脂平板上，通过观察平板菌落生长情况判定MIC值。但此研究确定的MIC是能抑制性50%菌落的最低抗生素浓度，而现在普遍认为，MIC是能抑制菌落生长的最低抗生素浓度。也有报道用E-Test方法在琼脂上检测较准确的MIC值，但限于成本高昂且生殖支原体在体外生长耗时长(>7 d)[7]，未能在临床推广。Bébéar等[8]应用琼脂稀释法检测了生殖支原体对莫西沙星的体外抗菌活性。近年很少有报道用琼脂稀释法来检测生殖支原体的体外药物敏感性。

1.2肉汤稀释法 目前，肉汤稀释法主要应用SP4液体培养基。将抗生素按2倍梯度稀释加入SP4培养基中，接种一定量的生殖支原体(通常104～106CFU/mL)，置于96微孔板中封板37 ℃孵育3～28 d，MIC值为抑制颜色改变的抗生素最低浓度。尽管这种药物敏感性试验方法简单易行、成本也相对不高，但生殖支原体在这种无生命的液体培养基中生长过于缓慢，很难用于临床常规检测。多数研究根据美国临床实验室标准化协会推荐的人型支原体MIC法进行生殖支原体的体外药物敏感性检测[9]。杨安波等[10]报道，应用商品化的生殖支原体药物敏感性试剂盒，评价了61例临床分离生殖支原体菌株对12种抗生素的敏感性。有研究应用一种无线磁电传感器装置，通过检测SP4培养基中生殖支原体生长时共振频率的变化，实时监测生殖支原体的生长，并应用该方法评价了四环素和左氧氟沙星的体外抗菌效果[11]。这种实时监测技术在研究充分的条件下，也许能弥补肉汤稀释法药物敏感性培养周期长这一缺陷。

琼脂稀释法是最早用于检测生殖支原体体外药物敏感性试验的方法，其次是应用SP4培养基的肉汤稀释法。尽管这种药物敏感性方法简单易行，成本也相对不高，但生殖支原体在这种无生命的液体培养基中生长过于缓慢，很难用于临床常规检测及科学研究，近年鲜有相关报道。

1.3细胞培养法 1996年Jensen等[12]首次用Vero细胞与患者标本共培养，进行生殖支原体分离培养并用PCR方法监测其生长情况。此后，细胞培养法便被大量应用到生殖支原体的初代分离及后续的体外药物敏感性试验中。将Vero细胞培养与TaqMan PCR技术同时应用于生殖支原体的药物敏感性监测已成为较成熟的技术[13-14]。TaqMan PCR是根据生殖支原体的生殖支原体Pa基因保守区设计的定量方法，将定量的DNA载量运用到抗生素对生殖支原体的抑菌率计算中，根据抑制率达到99%时的最低抗生素浓度确定MIC值。Mondeja等[15]对上述的培养方法做了改进，培养成本适当降低。Hamasuna等[16]将肉汤稀释法与细胞培养法进行比较，发现两者测得的MIC值结果相近。相对于肉汤稀释法，该法明显缩短了培养时间，在科研工作中被广泛应用。但成本相对提高且对技术要求相对更高，目前也仅限于研究。

耐药性检测除了上述的体外药物敏感性试验外，临床治疗效果观察也被视为一个手段。另外，针对生殖支原体的耐药位点进行DNA水平的耐药性检测已经逐渐被临床应用，与DNA鉴定同时检测即可完成生殖支原体的鉴定与药物敏感性预测，极大解决了生殖支原体培养及体外药物敏感性试验生长困难、耗时长的问题。核酸技术的迅速发展为生殖支原体这种人工培养较难的支原体的研究提供了更多的手段，在前述的众多研究基础上，开展生殖支原体的检测及耐药性监测正在临床诊治和科学研究中逐渐变得可行。

2 生殖支原体对四环素类的耐药现状及耐药机制

四环素类药物的抗菌作用方式是通过与细菌核糖体30S亚基的A位点结合抑制氨酰基tRNA与核糖体的作用，从而阻断肽链的延长及蛋白的合成。四环素、米诺环素和多西环素作为代表药物，在治疗支原体感染时，尤其是解脲支原体，敏感性较好。多西环素作为治疗NGU的一线药物，在一部分地区被用来经验性治疗生殖支原体所致的泌尿系感染。但从大量的临床治疗发现，多西环素在治疗生殖支原体感染时的治愈率低，常延误正确的治疗而发生持续感染，并且治愈率还在不断下降[17]。

由于生殖支原体没有针对体外药物敏感性的标准，参考肺炎支原体的体外药物敏感性折点MIC≤2 mg/L计算，则生殖支原体对于多西环素在体外药物敏感性试验非常敏感，但这与临床治疗效果不符。有学者提出应将生殖支原体的药物敏感性折点降低至MIC≤0.25 mg/L[18]，应用新折点再解释生殖支原体感染治疗失败就发现，治疗失败率与生殖支原体对多西环素的体外不敏感率几近吻合，但这一现象尚需进一步研究探讨。目前，在报道中仅有发现生殖支原体对四环素及多西环素在体外的敏感性出现降低及临床上的治疗失败的现象，并未发现其相关的耐药基因突变。在人型支原体和解脲支原体中检出的与四环素类耐药相关的tetM基因突变，并未在生殖支原体菌株中检出，且尚未发现新的与其相关的耐药机制。鉴于多西环素治疗生殖支原体感染效果不佳，该药不被推荐作为生殖支原体感染的治疗，或者仅在一、二线治疗生殖支原体感染的药物均无效的情况下使用。

3 生殖支原体对大环内酯类的耐药现状及耐药机制

细菌的核糖体50S大亚基是大环内酯类抗生素的作用靶位，主要由23S rRNA和核糖体蛋白(L22核糖体蛋白和L4核糖体蛋白)构成。细菌对大环内酯类药物有多种耐药机制，从对肺炎支原体和解脲支原体的大量研究中发现，支原体对大环内酯类的耐药机制主要是23S rRNA基因和核糖体蛋白基因L4、L22的基因突变，导致药物作用靶位改变[19]。国内关于生殖支原体对于该类药物耐药机制的研究不多。但国外的诊疗指南指出阿奇霉素是临床上治疗生殖支原体感染所致NGU的一线药物。近年报道发现，生殖支原体对其的耐药性已相当严重了，且耐药率还在不断上升[20]。

从临床标本中分离或检测到的大量阿奇霉素耐药菌株，携带23S rRNA基因2058和或2059位点突变[21-22]，这两个位点位于该基因Ⅴ区。其单核苷酸突变类型，在生殖支原体中的检出率由高到低依次为 A2058G，A2059G，A2058T，A2058C，A2059C和A2059T[18]。除了上述两个位点，23S rRNA其他位点突变也可能导致耐药，但少有报道。目前，23S rRNA基因的2058和2059碱基位点突变被普遍认为与生殖支原体抵抗阿奇霉素的机制有关，最新的治疗及诊断指南都将该位点的检测推荐应用于NGU患者的诊治[23-24]。有些地区早在2008年就开始对临床标本常规检测生殖支原体的大环内酯类耐药基因[14]。在北欧部分国家的调查研究显示，23S rRNA的突变率在生殖支原体感染的患者标本中达41%[25]，而加拿大有47.3%[26]，新西兰有72%[27]。如此高的突变率，研究者认为可能是该地区常规用阿奇霉素单剂1 g治疗生殖支原体感染患者，造成耐药菌株的筛选，其他的研究也支持此观点[28-29]。

新药交沙霉素和普那霉素被用来治疗多重耐药的生殖支原体感染，但仅在有限的地区使用[2,23]，近年来研究显示，这些药物也出现了临床治疗失败的案例。Guschin等[30]在1例久治不愈的生殖支原体感染患者中发现了23S rRNA基因的2062位碱基由A突变成了T的生殖支原体菌株，这一突变位点在肺炎支原体和人型支原体中报道与交沙霉素高水平耐药有关，与带有十六碳内酯环的药物耐药性相关，而并不影响十五碳内酯环的药物的敏感性。因阿奇霉素与交沙霉素内酯环结构上的差异，理论上A2062T位点不参与抵抗阿奇霉素的机制。

L22与L4核糖体蛋白形成的环形结构与大环内酯类药物结合空间位置有关，其内酯环结构对应的氨基酸位点是L22为Arg88-Ala93，L4为Gln62-Gly66(参考大肠埃希菌相应蛋白中的氨基酸位置)[31]。该区域的氨基酸改变可能导致核糖体的空间构象改变，进而导致大环内酯类药物不能与靶位结合而失去抗菌作用。Jensen等[14]发现4株L22基因突变导致的单个氨基酸发生替换，但位点均不在上述位置。其他关于L4突变的研究未发现明确的证据证明与大环内酯类耐药性相关[19]。但在肺炎支原体耐药性研究中发现，核糖体蛋白L4和L22突变仅可能导致其低水平耐药，常与23S rRNA基因Ⅴ区突变同时存在。

4 生殖支原体对喹诺酮类的耐药现状及耐药机制

喹诺酮类药物中的莫西沙星是治疗生殖支原体感染的二线药物，通常用于对阿奇霉素治疗失败病例。随着莫西沙星在治疗中的应用，耐喹诺酮类的生殖支原体菌株不断增多，在许多地区已经出现了与大环内酯类相同的耐药趋势[32]。在亚太地区和英国都有莫西沙星治疗生殖支原体感染失败的案例，前者的发生率更高[33-34]。西他沙星被认为与莫西沙星有着相同的抗菌效果，在日本等地有较多的临床应用。而氧氟沙星和左氧氟沙星的体外及体内抗生殖支原体效果均较弱，未被推荐作为临床治疗生殖支原体感染用药[35]。

生殖支原体对喹诺酮类药物耐药的机制与喹诺酮耐药决定区(the quinolone resistance-determining region，QRDR)突变有关。QRDR包括旋转酶gyrA、gyrB基因和拓扑异构酶ⅣparC、parE基因的某些区域。喹诺酮类药物通过与酶蛋白-DNA复合体结合，阻止DNA复制，进而达到抗菌目的。研究发现，临床菌株中parC的单核苷酸突变所致拓扑异构酶Ⅳ氨基酸改变与生殖支原体对莫西沙星和西他沙星耐药高度相关且发生率渐增(37%～47%)，其常见氨基酸突变位点及突变模式为S83I、S83N、D87N、D87Y和D87H[34,36-39]，其中以S83I和S83N最为重要。其次报道较多的是gyrA基因突变，所致的旋转酶氨基酸位点及突变模式为D87N[40]。总的来说，parC或gyrA发生单核苷酸突变时可造成生殖支原体对喹诺酮类药物敏感性明显降低，而同时携带上述两种基因的单核苷酸突变时，生殖支原体通常会对喹诺酮类药物显示出高水平耐药。研究还发现，不同的突变模式可能涉及不同药物的敏感性，如parC的突变模式S83I对莫西沙星的MIC值有明显影响，而对西他沙星的MIC值影响稍小[34,40]。QRDR的另外两个区域parE和gyrB，其突变位点并未被大量研究，主要原因可能是其突变发生率较低。仅有的少量研究显示，当其与parC上述突变联合存在时，常导致对喹诺酮类的高水平耐药[32]。临床随访研究显示，QRDR突变的出现可能并不是由于治疗生殖支原体时药物筛选的结果[41]，不同突变位点的出现及对其他喹诺酮药物的影响仍在研究中。

5 小 结

目前，生殖支原体被认为是仅次于沙眼衣原体的NGU致病菌，在体外的常规培养及药物敏感性监测均较困难，临床上又快速出现了对一线、二线抗生素的抵抗，使得治疗难度加大。国内外对生殖支原体耐药及机制研究已从之前体外药物敏感性方向转向对其DNA水平方向，并主要集中对大环内酯类和喹诺酮类耐药机制的上。研究其耐药机制及开发新的更有效的抗生素是目前生殖支原体研究中亟待解决的问题。鉴于目前的研究结果，建议对于初诊NGU患者，应使用PCR检测是否为生殖支原体感染，并对大环内酯类耐药相关的23S rRNA基因位点及喹诺酮类耐药相关的parC，gyrA基因位点进行检测，根据检验结果和治疗指南再调整合理的治疗方案，避免经验性用药治疗，以防生殖支原体治疗失败或持续感染，甚至造成对耐药菌株的筛选。