HBcrAg在慢性乙型肝炎临床诊疗中的研究进展

王施刚，杨 春

(重庆医科大学附属第一医院感染科，重庆400016)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一个全球性问题，全世界约有2.4亿慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者[1]。有8%～20%的CHB患者在5年内发展为肝硬化，10%～17%的肝硬化患者在5年内发展为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[1-2]。被HBV感染的肝细胞的细胞核中存在共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)，其导致了治疗中断后高复发率的问题[3]。目前，通常以乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)的血清学转换以及血清HBV DNA水平检测不出来作为抗病毒治疗的终点[3]。然而，即使血清HBeAg转阴、血清HBV DNA检测不到后，部分患者仍可能发生肝硬化和肝癌[3]。肝活检对肝内cccDNA和肝内HBV DNA进行定量检测能最准确地反映病毒载量，但由于是侵入性检测方法，存在抽样误差，且缺乏标准化的检测方法，目前在临床实施较为困难。乙型肝炎核心相关抗原(hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)作为HBV感染的一种血清学标志物，其水平可较好地反映HBV DNA和肝内cccDNA的情况[4]。HBcrAg检测方法简便、临床可操作性强，具有良好临床应用前景。现就HBcrAg在CHB中的研究进展进行综述。

1 HBcrAg的组成及检测方法

HBcrAg是HBV感染的一种血清学标志物，由HBeAg、乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)以及一种核心相关蛋白(p22cr)组成，主要在不含HBV DNA的病毒颗粒中发现[5]。HBcAg、HBeAg以及p22cr均是前c/c区的编码产物，有相同的149个氨基酸序列[4]。HBV进入肝细胞内，并在细胞核中形成稳定的cccDNA后，HBV开始转录形成各种信使RNA(messenger RNA，mRNA)。这些mRNAs编码各种结构和非结构蛋白。HBcAg是病毒衣壳的结构成分，可在成熟病毒体中发现。HBeAg是一种非结构性HBV蛋白，是前c区N端加工产物。与HBeAg一样，p22cr也是一种前c区核心蛋白的加工产物，且可以存在HBV DNA阴性和HBcAg缺乏的Dane样颗粒中。

目前主要采用化学发光酶免疫分析检测HBcrAg[6]。因HBcAg、HBeAg和p22cr具有相同的氨基酸序列，故一株单克隆抗体即可检测这3种蛋白质。将血清样品与抗HBcrAg包被的微孔板混合形成抗原-抗体免疫复合物，再用碱性磷酸酶标记的抗HBcrAg结合微孔板上的免疫复合物，最终形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，通过测定复合物的发光强度定量样品中HBcrAg的含量。该方法检测的下限为2.0 lgU/mL，线性范围为3.0～7.0 lgU/mL(1 kU/mL=3 lgU/mL)。对于HBcrAg>7 lgU/mL的样品，可通过样品稀释来定量HBcrAg的水平。

2 HBcrAg与肝内cccDNA和HBV DNA的关系

目前，肝内总HBV DNA与肝内cccDNA的相关性最强(r=0.83，P<0.000 1)，血清HBcrAg、HBV DNA与cccDNA的相关性较强(r均=0.70，P<0.000 1)，乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)与cccDNA的相关性较弱(r=0.40，P<0.000 1)[7]。肝内HBV DNA的检测受肝活检的限制。接受核苷酸类似物[nucleotide analog，NA(s)]治疗的患者，在1年的时间内通常检测不到血清HBV DNA。因此，不能使用血清HBV DNA作为cccDNA的替代指标，用血清HBV DNA反映cccDNA含量的可靠性也较差[7]。理论上，HBsAg是反映病毒活性和肝内cccDNA水平的血清标志物，但在接受NA(s)治疗的患者中，即使HBV DNA检测不到时，HBsAg仍可检测到，HBsAg与cccDNA只有弱相关性[8]。与cccDNA相关性较弱的一个原因可能是肝内HBV的复制率较低，此外也存在大量循环空HBsAg颗粒。HBsAg与cccDNA的弱相关性在其他研究中也有报道[9]，因此HBsAg并不是一个较理想的cccDNA替代指标。

尽管肝内总HBV DNA、血清HBV DNA以及HBcrAg均与cccDNA具有良好的相关性，但HBcrAg与前两种标志物相比具有一定的优势。与血清HBV DNA一样，测量HBcrAg不需要肝活检，因此较肝内HBV DNA测量更有可行性。此外，HBcrAg测量相对于血清HBV DNA也具有优势，即使血清HBV DNA检测不到时大部分患者仍可检测到HBcrAg。在305例接受NA(s)疗法的患者中有130例患者检测不到血清HBV DNA，进一步对这130例患者进行分析发现，78%的患者可检测到HBcrAg，且HBcrAg与cccDNA呈正相关(r=0.42，P<0.000 1)[7]。综上，在HBV的标志物中，HBcrAg是最适合反映肝内cccDNA水平的标志物。

无论是在临床还是实验室环境中，HBcrAg的检测都很方便。与血清HBV DNA检测不同，HBcrAg检测不需要使用聚合酶链反应扩增技术。同时，HBcrAg检测所需的血清样本量(150 μL)也低于大部分血清HBV DNA检测所需的血清样本量(通常为0.5～1 mL)[7]。

3 HBcrAg有助于确定CHB的阶段

对于HBeAg阳性患者，较低的HBcrAg水平提示患者处于强烈的免疫控制之下[10]。Seto等[10]研究发现，HBeAg阳性的HBV感染者和HBeAg阳性的CHB患者HBcrAg的水平分别为8.54 lgU/mL和7.92 lgU/mL，两者比较差异有统计学意义，但HBcrAg水平能否反映免疫清除活性还需要进一步研究。此外该研究还发现，HBeAg阳性者HBcrAg的水平高于HBeAg阴性者[10]，这与HBeAg血清转换后HBeAg的产生减少有关。与HBeAg阳性者不同，若HBeAg阴性者(尽管HBcrAg的水平低于HBeAg阳性者)在HBeAg血清转换后仍有较高的HBcrAg水平，提示患者免疫清除水平较低。研究表明，HBeAg阴性HBV感染者HBcrAg的水平明显低于HBeAg阴性的CHB患者(2.60 lgU/mL比4.92 lgU/mL，P<0.001)；与HBeAg阴性的HBV感染者相比，HBeAg阴性CHB患者的HBcrAg水平升高，与更明显的坏死性炎症和纤维化有关[11]。

另外，对于发生了HBsAg血清学转换的55例患者来说，71%的患者无法检测到血清HBsAg的水平，这表明病情较为稳定，但仍可在12例患者的血清中检测到HBcrAg，其HBcrAg的中值为2.7 lgU/mL[10]。HBsAg的血清清除并不意味着HBV的清除。有研究发现，对发生HBsAg血清转换的CHB患者进行肝活检仍可检测到cccDNA，且有46.2%(6/13)的患者血清HBcrAg阳性[12]。

上述发现为HBcrAg进一步确定CHB的感染阶段提供了潜在的证据。最新欧洲肝病学会指南指出，HBcrAg有助于确定慢性HBV感染的阶段，尤其是HBeAg阴性者[13]。目前各阶段划分的最佳截止值仍有待确定，未来期待有更多大样本、更长周期的前瞻性研究进一步探索。

4 HBcrAg检测的临床意义

4.1对抗病毒治疗的监测

4.1.1聚乙二醇干扰素治疗 聚乙二醇干扰素可调节免疫力，直接抑制病毒，还可以抑制病毒DNA和cccDNA的复制。病毒HBcrAg的动态变化可以评估聚乙二醇干扰素治疗CHB的效果。Chuaypen等[14]对46例接受聚乙二醇干扰素处理48周的HBeAg阳性CHB患者外周血中HBcrAg的水平进行动态监测发现，15例(32.6%)患者在治疗24周后出现病毒学应答(定义为HBeAg清除和HBV DNA <2 000 IU/mL)。与无应答者相比，应答者cccDNA显著下降，基线HBcrAg水平与cccDNA相关(r=0.564，P=0.001)，治疗期间相应标志物的变化与cccDNA的减少相关(r=0.503，P=0.005)；与无应答者相比，应答者在治疗期间HBcrAg的水平下降更快，且与cccDNA一致；多变量分析显示，第12周时血清HBcrAg的水平是病毒学应答的预测因子，HBcrAg的最佳临界值是8 lgU/mL。治疗12周和24周时病毒学应答的阴性预测值(negative predictive value，NPV)分别为94.4%和100%。因此可根据HBcrAg的水平预测CHB患者对抗病毒治疗的反应。

对于HBeAg阴性的CHB患者，定量HBcrAg已被提议作为定量HBsAg的额外标志物。Chuaypen等[15]对121例HBeAg阴性的CHB患者进行48周聚乙二醇干扰素单独或与恩替卡韦联合治疗。持续病毒学缓解(持续HBV DNA<2 000 IU/mL)和治疗3年后HBsAg的清除率分别为29%(35/121)和9%(11/121)；基线HBcrAg与HBV DNA和cccDNA相关，但与HBsAg无关；基线HBsAg的水平以及HBsAg和HBcrAg的下降与持续病毒学缓解相关，而HBsAg的下降可预测HBsAg的清除率；高基线抗原水平(HBsAg≥3 400 IU/mL以及HBcrAg≥3.7 lgU/mL)导致高的持续病毒学缓解阴性预测值和HBsAg清除率[15]。Martinot-Peignoux等[16]对62例HBeAg阴性CHB患者使用聚乙二醇干扰素单独或联合替诺福韦酯治疗，随访发现，基线血清HBcrAg水平预测治疗1年的持续病毒学应答的受试者工作特征曲线下面积是0.668，临界值为3.45 lgU/mL时的阴性预测值是72%，HBcrAg与HBsAg联合时受试者工作特征曲线下面积可达0.745[16]。定量HBcrAg与HBeAg阴性CHB患者的cccDNA显著相关，与HBsAg联合可以识别长期随访中持续病毒学缓解和HBsAg清除率低的患者[16]。

4.1.2核苷酸类似物治疗 治疗前，HBeAg阳性或阴性的CHB患者均可检测到HBcrAg，HBeAg阴性者HBcrAg的水平低于HBeAg阳性者[17]。虽然HBcrAg与HBV载量高度相关，但抗病毒治疗后HBcrAg的下降与HBV DNA相比并不太明显。NA(s)治疗期间血清HBV DNA的水平低于最低检测限时，大部分患者的HBcrAg仍可检测[7]。两者的差异可用NA(s)对逆转录和HBV DNA复制的抑制来解释，而HBcrAg是由cccDNA转录的mRNA翻译产生，故HBcrAg的产生不受抗病毒药物的影响[18]。对94例接受过8年连续NA(s)治疗的患者进行研究发现，无论是HBeAg阴性还HBeAg阳性者，血清定量HBcrAg的水平从基线到第8年呈现逐年下降的趋势[19]。经过8年的NA(s)治疗后，根据血清HBcrAg和HBsAg评分系统危险分层规律，只有3.2%的患者可达到NA(s)戒断后低复发风险的标准，说明目前长期NA(s)治疗是必要且重要的[19]。

4.2对病情复发和耐药性的预测 由于NA(s)不能直接抑制cccDNA，部分患者在停药后易复发，因而必须长时间服用药物，甚至终身服药[20]。在长期抗病毒治疗期间，一些患者可能发生与耐药相关的基因突变，从而导致HBV DNA重新出现，肝炎复发，甚至发生肝功能衰竭。因此，预防患者产生耐药以及停药后复发非常重要。HBcrAg可能是监测药物耐药和停药后复发的潜在生物标志物。

血清HBcrAg的水平可预测病情复发，特别是对于HBeAg阴性的CHB患者[13]。对113例达到NA(s)停药标准后停药的CHB患者进行随访发现，停止NA(s)治疗后1年内有63例患者发生病毒学复发，其血清HBcrAg水平较未复发者高，故血清HBcrAg较血清HBV DNA能更好地评价、预测CHB患者停药后复发[21]。NA(s)治疗结束时HBcrAg>3.7 lgU/mL是预测病毒学复发的独立危险因素(OR=3.751；95%CI1.187～11.856，P=0.024)。Matsumoto等[22]对34例停用拉米夫定治疗的CHB患者进行随访发现，无论HBeAg阳性还是阴性患者，复发者HBcrAg的水平较未复发者高(HBeAg阴性：4.8 lgU/mL比3.0 lgU/mL，P<0.05；HBeAg阳性：5.9 lgU/mL比5.6 lgU/mL，P>0.05)，但是复发组与未复发组血清HBV DNA水平差异无统计学意义。进一步研究发现，血清HBcrAg>3.0 lgU/mL的CHB患者在停用NA(s)治疗后1年内乙型肝炎的复发率为90%(47/53)，且复发率随着HBcrAg水平的升高而升高[23]。因此，CHB患者治疗结束后对血清HBcrAg的水平进行动态监测可帮助识别复发的高风险人群，从而可对高危人群进行有针对性的密切随访。

对采用拉米夫定治疗的CHB患者进行研究发现，治疗2年时HBV DNA>2.6 log拷贝/mL的患者的耐药率明显高于HBV DNA≤2.6 log拷贝/mL者(P<0.001)，且血清HBcrAg的水平降低的慢于血清HBV DNA，治疗后HBcrAg的水平较低者更不易发生耐药，血清HBcrAg<4.7 lgU/mL的患者未出现耐药情况。81例CHB患者接受拉米夫定治疗半年后发现，血清HBV DNA阴性者56例，随访2年发现30%的患者出现耐药[24]。以上研究表明，血清HBV DNA测量对于鉴定拉米夫定耐药高风险人群是有价值的；而血清HBcrAg测量对于鉴定拉米夫定耐药低风险人群同样也具有价值。对50例采用聚乙二醇干扰素联合NA(s)治疗[聚乙二醇干扰素联合NA(s)治疗4周后聚乙二醇干扰素治疗20周，共治疗24个月]的CHB患者进行研究发现，治疗开始时HBsAg高水平(>3.0 lgU/mL)和HBcrAg高水平(>4.5 lgU/mL)是完成治疗时无应答、无HBeAg血清转换的重要预测因素[25]。综上，血清HBcrAg的水平反映的是肝细胞内cccDNA的水平，其对于筛选CHB抗病毒药物的耐药性方面有重要作用，可用于预测抗病毒的疗效。

4.3对肝癌及肝移植患者的病情评估 HBcrAg检测对HCC的发生具有重要预测价值[26-28]。对未接受治疗的CHB患者进行平均10.7年的随访发现，HBcrAg预测HCC的发病优于血清HBV DNA和HBeAg，HBcrAg>2.9 lgU/mL是HCC发生的独立预测因子(HR=5.05，95%CI2.40～10.63)[26]。对于接受治疗的患者，NA(s)治疗后HBcrAg阳性至少2年是HCC的独立危险因素[27]。76例CHB患者采用NA(s)治疗后均检测不到血清HBV DNA，与未发生HCC患者相比，HCC组治疗前HBcrAg水平显著增高(5.45 lgU/mL比4.55 lgU/mL，P=0.005)。治疗前HBcrAg>4.67 lgU/mL和治疗后HBcrAg>3.89 lgU/mL均能独立预测HCC[28]。HBcrAg也被用来预测HCC切除或射频消融后的复发。对NA(s)治疗期间发展为HCC并进行根治性切除术或经皮消融治疗的患者研究发现，血清HBcrAg>4.8 lgU/mL时，2年内HCC复发的危险比为8.96(95%CI1.94～41.4)[29]。

肝移植可用于治疗HBV感染相关的肝硬化和肝癌，由于肝外器官并未完全清除HBV，因此肝移植后需要终身抗病毒治疗。对于此类患者，因为已经慢性感染，故治疗的目标是防止移植物复发肝炎。在肝移植患者中，虽然HBcrAg与肝内cccDNA存在显著相关性(r=0.616，P<0.001)[30]，但HBcrAg在预测HCC复发、HBV再感染方面的作用尚待确定。Urabe等[31]对21例肝移植前患有HCC的患者进行随访发现，肝移植后有5例出现HCC复发(HBcrAg阳性的14例中有2例复发，HBcrAg阴性的7例中有3例复发)，HBcrAg阳性与肝移植后HCC的复发风险无显著相关性。对32例肝移植患者进行随访发现，有6例出现HBsAg和(或)HBV DNA，16例(50%)检测到HBcrAg[31]。未来可进一步探索HBcrAg是否可以作为肝移植后乙型肝炎免疫球蛋白和NA(s)治疗停止的标志。

4.4对使用免疫抑制剂人群HBV再激活的预测 对于隐匿性HBV感染者，如果使用免疫抑制治疗或接受造血干细胞移植有HBV再激活的风险[32-33]。随访63例接受利妥昔单抗化疗的患者发现，治疗2年时观察到26例患者发生了HBV再激活，其再激活率高达41.5%[32]。另有研究随访了62例接受造血干细胞移植的患者，2年时HBV累积再激活率为40.8%[33]。对接受利妥昔单抗化疗或造血干细胞移植的124例亚洲患者进行研究发现，基线HBcrAg阳性是HBV重激活的一个重要危险因素，与HBcrAg阴性患者相比，血清HBcrAg阳性超过2年时HBV再激活率显著更高(P=0.002)[34]。2017年的欧洲肝病学会指南建议，对于HBV再激活风险中等(<10%)或较低(<1%)的单项抗-HBc阳性患者，在接受免疫抑制治疗时，推荐每1～3个月监测HBsAg和(或)HBV DNA，一旦检测到HBsAg或HBV DNA逆转，立即开始抗病毒治疗[13]。HBcrAg可能在加强HBsAg或HBV DNA监测甚至预防性抗病毒治疗中发挥作用，未来需要进一步研究上述人群中HBV再激活的最佳监测指标，并确定开始治疗的最佳时间点。

5 小 结

HBcrAg作为非侵袭性指标，是肝内cccDNA的良好替代物，通过检测患者的血清标本即可获得，有助于确定CHB疾病的阶段，可准确反映CHB患者抗病毒治疗效果，预测CHB患者复发、耐药性以及HCC的发生。未来需进一步探索HBcrAg在肝移植患者中预测HCC复发、HBV再感染以及使用免疫抑制剂治疗的CHB患者中的作用。HBcrAg作为一项新的指标，在临床常规使用之前需要进行更广泛的临床验证。相信随着医疗技术的发展，未来会有更多关于HBcrAg的临床应用证据，并逐渐被人们所认可。