miR-145在肿瘤耐药中的研究进展

武 磊，李 洁，邹余粮

(西安交通大学第一附属医院妇产科，西安 710000)

近年来，曾被认为是“转录噪声”的微RNA(microRNA,miRNA)与癌症的关系研究已成为热点。miRNA在功能上涉及几乎所有的生理过程，包括细胞分化、增殖、代谢、凋亡和炎症等，调控各种细胞信号通路。研究发现，与癌旁的正常细胞相比，癌细胞中miRNA的表达谱发生了改变。在多种人类癌症发生过程中，miRNA可作为癌基因和抑癌基因。进一步研究证明，一部分miRNA通过肿瘤干细胞[1-2]、肿瘤血管再生[3]、肿瘤相关巨噬细胞[4]、上皮-间质转化[5]等途径调控恶性肿瘤的侵袭和转移。有研究证明，可通过检测血清miRNA的含量，预测器官损伤及病变风险[6]。随着对化疗耐药研究的深入发现，miRNA可为逆转化疗耐药提供一条新途径。在癌症耐药细胞中，miR-145表达下调，体外实验miR-145表达升高，可逆转耐药。然而，每个miRNA都不是单独存在的，体内有着复杂的内源竞争RNA调节网络[7]，miR-145的下调受到长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)以及信使RNA(messenger RNA,mRNA)的影响。现对miR-145在肿瘤耐药中的研究进展进行综述。

1 miRNAs与肿瘤耐药

miRNAs是一段长20～24 nt的单链非编码蛋白RNA。在人类基因组中，已经被确认的miRNA约有2 500种，参与超过30%蛋白质编码基因的调节[8]。其转录本在RNA聚合酶Ⅱ的作用下生成初级转录本；然后经DiGeorge综合征危象区基因8(DiGeorge syndrome chromosomal region 8，DGCR8)和Drosha复合体的作用，生成miRNA前体，最后在Dicer酶作用下生成长度为19～22个核苷酸的成熟双链miRNA[9]。主要通过末端的“种子”区域与mRNA的碱基配对互补，从而负调节mRNA翻译，进一步影响蛋白质的表达。miRNA-mRNA结合位点很短(6～8个碱基对)，单个miRNA可能潜在靶向数十至数百个mRNA[10]，因此每个miRNA都可在不同生物途径中发挥作用。

目前的研究已经发现很多与肿瘤耐药相关的miRNAs。它们参与耐药的相关机制：①通过细胞凋亡的异常调节[11]。如miR-15b/16通过抗细胞凋亡参与胃癌多药耐药的发展[12]。在乳腺癌中，miR-497上调可促进细胞凋亡，增强细胞对化疗药的敏感性[13]。②影响细胞周期[14]。在乳腺癌中，与敏感细胞相比，MCF-7细胞中miR-221/222的上调参与获得性氟维司群耐药性[15]。miR-200b可靶向转录因子E2F3，维持正常细胞周期进展,可作为人肺腺中多西紫杉醇的化学敏感性恢复剂起作用[16]。③调节药物外排转运蛋白表达[17]。腺苷三磷酸结合盒转运体蛋白家族成员的高表达，参与肿瘤复发和对化学治疗的耐药性。Borel等[18]将19种配对的肝细胞癌与健康组织进行比较，确定了上调和下调79种miRNA的情况。经荧光素酶检测发现，miR-101和miR-135b下调腺苷三磷酸结合盒转运体蛋白A1，miR-199a/b和miR-296下调腺苷三磷酸结合盒转运体蛋白C1，腺苷三磷酸结合盒转运体蛋白C4是miR-125a/b的直接靶标，腺苷三磷酸结合盒转运体蛋白C5被miR-101下调，腺苷三磷酸结合盒转运体蛋白C10是let-7a/e的靶标，并且腺苷三磷酸结合盒转运体蛋白E1由miR-26a、miR-135b和miR-145直接下调。miR-200c的上调通过降低腺苷三磷酸结合盒转运体蛋白B1的表达增强了MCF7乳腺癌细胞对表柔比星的化学敏感性[19]。④通过自噬参与肿瘤耐药。miR-30a通过靶向Beclin-1而抑制自噬活性，从而有效提高肿瘤细胞对顺铂的敏感性[20]。miRNA的异常表达与肿瘤的发生和进展相关，并且已显示其表达的逆转调节癌症表型，表明miRNA作为抗癌药物靶标的潜力。

2 miR-145与肿瘤耐药

2002年，Lagos-Quintana等[21]检查了9种不同的小鼠组织，通过组织特异性鉴定，发现34种新的miRNA，其中包括miR-145。并鉴定出miR-145的序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUU。2003年，Michael等[22]在研究人结直肠腺癌时发现了人miR-145，鉴定其序列为:GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCC。人鼠同源，故大量体内实验基于小鼠完成。人的miR-145位于染色体5q32。具有高度的保守性、时序性和组织特异性，具有miRNA的一切特点，调节多个靶基因，通过降解靶基因mRNA，参与调控真核细胞的活动程序。研究表明，在乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌等癌症中miR-145表达恒定下调[23-29]。而在正常中胚层组织中如卵巢、子宫、睾丸、前列腺、心脏中富含miR-145[30]。目前，已经明确miR-145可通过调控靶基因影响肿瘤细胞的生长、分化、凋亡、侵袭等过程[31-35]。

2.1miR-145与卵巢癌 卵巢癌是女性三大恶性肿瘤之一,其死亡率位于妇科癌症之首，大多数患者就诊时已为晚期。紫杉醇和铂类作为一线化疗药物是治疗晚期卵巢癌的主要手段，但化疗后的耐药复发为治疗带来极大阻碍。在卵巢癌细胞中，miR-145表达下调。有研究发现,miR-145在人卵巢癌SKOV3/顺铂细胞株中的表达低于在人卵巢癌SKOV3细胞株中表达，同时在裸鼠体内形成的移植瘤中，人卵巢癌SKOV3/顺铂细胞株中的表达也低于人卵巢癌SKOV3细胞株中表达，即无论体内体外，其在耐药细胞系中的表达均低于非耐药细胞系[36]。Zhu等[37]将miR-145 mimic导入SKOV3/紫杉醇和A2780/紫杉醇细胞，发现过表达miR-145能降低胞内的Cdk6和Sp1水平，阻断致癌转录活性，从而导致G1细胞周期阻滞。此外，他们还发现，miR-145在体内体外均能增强细胞对紫杉醇的敏感性。Twist是一个导致耐药的基因，Twist的增加是鼻咽癌细胞获得性紫杉醇耐药性的发展和Twist的异位表达对微管破坏剂(包括紫杉醇)的抗性[38]。在卵巢癌细胞系研究中，发现Twist被miR-145直接靶向[39]。与临床情况相关的是，Twist在晚期卵巢癌患者中高表达。Twist高表达的上皮性卵巢癌患者预后不良[40]。故在卵巢癌中，过表达miR-145可能通过靶向Twist，而减弱卵巢癌的紫杉醇耐药以及改善预后。

2.2miR-145与宫颈癌 宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤。随着三级筛查的稳定实施，宫颈癌得以早期发现和治疗。目前认为宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒长期感染有关。在宫颈癌细胞中，miR-145表达下调。人乳头瘤病毒致癌蛋白E6参与宫颈癌耐药。糖皮质激素通过诱导宫颈癌细胞中人乳头瘤病毒致癌E6蛋白调节p53-miR-145途径，使miR-145的表达下调，阻止化疗诱导的细胞凋亡，而miR-145的过表达逆转了由糖皮质激素诱导的丝裂霉素耐药性[41]。张鸿博[42]通过向宫颈癌Hela细胞中导入外源性miR-145-5p mimics，应用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐方法研究其对紫杉醇敏感性的影响。以相对细胞增殖活性反映转染前后细胞增殖能力的变化。结果显示转染miR-145-5p能增加Hela细胞对化疗药物的敏感性。

2.3miR-145与乳腺癌 乳腺癌是全球女性癌症死亡的最常见原因。迄今，miRNA与乳腺癌的关系研究已取得很大进展。miR-145在乳腺癌临床样本中显著下调，并且与乳腺癌细胞系和临床乳腺癌组织中的多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)表达水平呈负相关。Gao等[43]通过质粒转染、荧光素酶测定，确定miR-145可以直接靶向MRP1。在体外，miR-145通过抑制MRP1诱导细胞内阿霉素累积，从而增加细胞对阿霉素的敏感性。在体内，强制表达miR-145增加了对基于MDA-MB-231细胞的裸鼠异种移植物中阿霉素的敏感性。研究结果证明miR-145使乳腺癌对阿霉素化疗敏感。另有研究显示，miR-145通过抑制Bcl-2和P糖蛋白的表达来增加阿霉素耐药性的MCF-7细胞对阿霉素的敏感性和凋亡[44]。

2.4miR-145与食管癌 我国是食管癌的高发地区，早期诊断和治疗技术等方面都取得了很大进步，但预后仍然较差。在食管癌中，miR-145对不同细胞的作用不一。王喜成[45]发现，miR-145过表达引起多药耐药基因(multidrug resistance,MDR)1、主穹隆蛋白的表达降低，并且，miR-145通过降低靶基因YES1的表达增加Eca109和EC9706细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性。Derouet等[46]选取3个对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)及顺铂双重耐药的细胞系，分别为OE33、SK-GT-4、FLO-1，经过研究发现，在OE33细胞中miR-145的表达对顺铂及5-FU的耐药性无影响；miR-145可增加SK-GT-4细胞对顺铂的抗性，但不影响其对5-FU的抗性；在FLO-1细胞中，miR-145减弱了对顺铂的抗性，但对5-FU抗性无影响。

2.5miR-145与胃癌 胃癌在我国发病率和死亡率位居第二位。尽管目前发病率有所下降，仍危害人类健康，且发病的具体分子机制未明。在胃癌细胞中，CD44+胃癌细胞具有肿瘤干细胞特性，并且对5-FU与依托泊苷等化疗药物有明显的耐药性[47]。Zeng等[48]通过研究发现，miR-145主要通过直接靶向CD44的3′-非翻译区调节CD44，抑制细胞自我更新特性并改善胃癌细胞的化学敏感性。胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)/胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)的激活可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。目前研究表明IGF-1R/IRS-1通路相关蛋白过表达与胃癌化疗效果、预后呈负相关[49]。而且卵巢癌的研究显示，在顺铂治疗周期中IGF-1R呈高表达，并参与耐药[50]。表明IGF-1R/IRS-1的激活表达与肿瘤的顺铂耐药相关。朱明霞等[51]通过双荧光素酶基因分析证实IGF-1R与IRS-1为miR-145的靶基因，并通过转染等方法验证miR-145通过靶向抑制IGF-1R和IRS-1表达调节胃癌细胞耐药。Law等[52]和Yin等[53]分别发现miR-145在肠癌和肝癌细胞中靶向抑制IGF-1R与IRS-1。

2.6miR-145与胰腺癌 胰腺癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，恶性程度高，诊断治疗困难。目前miRNA作为胰腺癌分子标志物的研究较多。P70S6K1是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路最重要的下游靶点之一，可被磷脂酰肌醇-3-激酶/第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物/蛋白激酶B信号通路激活。证据表明p70S6K1通路参与细胞生长、凋亡、转移和耐药等多种细胞功能[54]。Lin等[55]在胰腺癌研究中发现，P70S6K1是miR-145的直接靶点，两者相互负调控。过表达p70S6K1可增强细胞耐药性，同时降低miR-145的表达水平。反过来，升高miR-145的表达水平，可增加耐药细胞对化疗药敏感性，同时抑制p70S6K1的表达。MUC13是一种跨膜黏蛋白，高度参与胰腺癌的进展。miR-145主要存在于正常胰腺组织和早期胰腺导管腺癌前体病变Ⅰ期中，并且在从前体病变Ⅱ/Ⅲ期发展到晚期低分化胰腺导管腺癌的过程中逐渐受到抑制。Khan等[56]的研究表明，高水平的miR-145可能以MUC13的3′非翻译区为靶点，抑制细胞内MUC13及其下游靶点ERBB2的表达，从而提高胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。

2.7miR-145与胆囊癌 胆囊癌是最常见的胆管系统恶性肿瘤，早期无特异临床表现，发现时多为晚期，且预后不良。Zhan等[57]研究发现miR-145在胆囊癌组织中下调。应用开放靶点预测程序，发现miR-145可以直接靶向MRP1基因。且通过实验证实miR-145和MRP1之间存在调节机制。过表达miR-145降低了MRP1的表达，而MRP1的减少又增强胆囊癌细胞的顺铂敏感性。并且在体内和体外得到了一致结果，证明上调miR-145可增强癌细胞对顺铂的敏感性。

2.8miR-145与结肠癌 结肠癌是世界三大最常见癌症之一，虽然可早期发现，转移发生也早。近年来与miRNA的关系研究已成为热点。付强等[58]研究证实miR-145可能通过增强抑癌基因PTEN的表达，削弱人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT-116/L-OHP的耐药性。另有研究发现，miR-145通过抑制靶基因GPR98的表达从而抑制HCT-116细胞的L-OHP的耐药性[59]。体外研究表明，细胞内MDR基因与P糖蛋白的表达水平越高，细胞耐药性越强[60]。Ikemura等[61]在miR-145与MDR1/P糖蛋白通路研究中行荧光素酶检测证实，miR-145的直接靶标是MRP1，miR-145可通过结合MRP1基因3′非翻译区调节该基因的翻译，下调其表达产物P糖蛋白。而细胞通过减弱P糖蛋白外排作用，使细胞毒性药物在细胞内蓄积从而增强药物敏感性[62]。

结肠癌的维罗非尼抗性细胞系colo205/V中，miR-145的表达显著低于正常colo205细胞系。miR-145的过表达可以增加colo205/V细胞对维罗非尼在体外和体内的敏感性[63]。另外结肠癌相关研究中，Akao等[64]通过浓度梯度法建立对5-FU耐药细胞系，发现敏感组细胞接触5-FU后细胞内中miR-145表达水平升高，但耐药组未出现相应变化。但药物作用后外排小泡中的miR-145表达水平下降，证明增加miR-145外排可能是结肠癌细胞产生奥沙利铂耐药的机制。

2.9miR-145与恶性胸膜间皮瘤 恶性胸膜间皮瘤比较罕见，是一种侵袭性的人类癌症。多数发现时已处于晚期，对常规治疗不敏感。在恶性胸膜间皮瘤细胞中，miR-145表达明显下降。Cioce等[65]研究发现，过表达miR-145，降低恶性胸膜间皮瘤细胞系的活力，阻止克隆形成以及迁移，并且加速细胞的衰老。miR-145通过特异性结合其3′非翻译区靶向八聚体转录因子4。抑制八聚体转录因子4及其下游物质E盒锌指结合蛋白1的表达，从而避免细胞产生耐药性[65]。

2.10miR-145与前列腺癌 前列腺癌严重威胁男性健康，延长生存期和提高生命质量的关键在于早期发现和有效治疗。在前列腺癌中miRNA的表达谱发生改变，一部分促进前列腺癌的形成及耐药，也有一些miRNA起到抑癌基因及抗耐药性作用。前列腺癌细胞中睾丸孤核受体4调节miR-145启动子的转录活性，miR-145调节八聚体转录因子4转录活性。故睾丸孤核受体4可通过睾丸孤核受体4-miR-145-八聚体转录因子4途径调控前列腺癌细胞的化疗耐药性[66]。He等[67]研究表明，前列腺特异性转录物1是lncRNA，在前列腺癌细胞中过表达，能促进前列腺癌细胞的增殖和转移，并引起肿瘤细胞对化疗药物的耐药。miR-145与前列腺特异性转录物1之间存在着双重负反馈调节，过表达的miR-145能抑制前列腺特异性转录物1的表达,从而抑制耐药进展。

2.11miR-145与肿瘤干细胞 肿瘤干细胞是指在肿瘤组织中具有自我更新、无限增殖和多向分化能力的一小部分细胞，并且能够产生该肿瘤一系列异质性肿瘤细胞的细胞亚群[68]，几乎所有的实体瘤细胞群体中均能分离得到。同时发现，肿瘤干细胞对常规化疗药物和放疗有更强的耐受能力，是耐药的主要原因[69]。

miR-145可以靶向多种干细胞因子，如八聚体转录因子4、性别决定区域Y基因2、Krüppel样因子4等，通过调节这些靶向因子的活动从而抑制肿瘤干细胞[70],进而可能逆转肿瘤的耐药。Chiou等[71]研究检测到，肺癌侧群细胞中miR-145表达水平下降明显，通过转染miR-145可以抑制肿瘤的生长及迁移、增强对抗肿瘤药物的敏感性，从而延长小鼠的存活期。干细胞多能基因Nanog的过表达与三阴性乳腺癌不良预后相关，并参与耐药。在乳腺癌研究中，miR-145高表达可通过降低Nanog逆转耐药[72]。

3 miRNA与逆转癌细胞耐药

逆转癌细胞耐药在治疗中显得尤为重要。miR-145在大多肿瘤中低表达，故可以设想通过升高miR-145的表达水平，达到抑制癌细胞增殖、分化以及耐药的效果。越来越多的研究发现miR-145在耐药细胞中发挥重要作用，但在人体复杂肿瘤微环境及竞争性内源RNA调控体系中，miR-145在耐药细胞中的表达同样受到其他因子调控。

有一些lncRNA存在与miRNA的互补序列，能够竞争性结合miRNA诱导沉默复合体，使miRNA诱导沉默复合体不能抑制相应mRNA的翻译。有研究显示，重编程调节子基因间非编码RNA可作为“海绵样”物质，诱导miR-145沉默，以调节乳腺癌转移、复发、耐药性[73]。同样，在食管癌研究中，miR-145受到重编程调节子基因间非编码RNA的竞争性结合，被降解，使得食管鳞状细胞癌的恶性增强[74]。在肺癌干细胞的研究中，发现miR-145受重编程调节子基因间非编码RNA/p53的调节，其对干细胞因子八聚体转录因子4、性别决定区域Y基因2等的作用被阻止，从而促进耐药[75]。lncRNA MALAT1可通过miR-145-5p介导的激酶锚定蛋白12调节增强前列腺癌细胞的多西紫杉醇抗性[76]。linc-DYNC2H1-4与miR-145竞争性结合并上调基质金属蛋白酶3水平，增强胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性[77]。

MiRNA的启动子区也存在CpG岛。Zhu等[37]用5-aza-dC行去甲基化处理A2780/紫杉醇和SKOV3/紫杉醇细胞后，miR-145表达被诱导增高约6倍(A2780/紫杉醇)或5倍(SKOV3/紫杉醇)，使EOC细胞对pacli-taxel敏感性明显增加[37]。提示miR-145也可以是卵巢癌多药耐药表观遗传治疗的靶点。因此，可以设想在侵袭性及耐药性肿瘤细胞中，miR-145的启动子区高度甲基化，抑制了miR-145的机体保护作用。此机制有待进一步验证。

4 小 结

miR-145是一个调控点，在肿瘤发生发展、耐药性、竞争性内源RNA网络以及表观遗传中，均参与调控和被调控。以其为作用靶点，调节其上游基因及靶基因相关因子，不失为一种有效研究途径。目前大多数实验在体外完成，在人体内部环境下，其表达以及调控情况尚未阐明。尽管如此，药物靶向治疗渐趋成熟，基于脂质体技术平台的miRNA药物输送技术已进入临床试验，对实体瘤患者进行尝试性治疗。而且外泌体的研究渐趋成熟，也将可能作为药物输送的载体。相信随着研究技术的不断提高、miR-145研究的持续深入，以miR-145为作用靶点开发新药，将会成为干预化疗耐药的一个重要手段。