百草枯暴露致帕金森病神经细胞程序性死亡机制研究进展

商跃云，张 慧

(天津市儿童医院急诊科，天津 300134)

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)又称震颤麻痹，是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其临床特征主要包括运动性症状(静止性震颤、肌张力升高、运动迟缓和姿势步态异常等)和非运动性症状(焦虑抑郁、睡眠障碍、自主神经功能障碍、嗅觉障碍等)，65岁以上人群PD的患病率约为1.7%，随年龄的增长，其发病率呈上升趋势[1]。研究发现，神经细胞尤其是黑质多巴胺能神经元死亡、脑内多巴胺缺乏、黑质纹状体多巴胺能通路受阻/路易小体形成均对PD的发生发展起重要作用，但具体病因尚不确切[2]。

神经细胞的死亡主要是细胞的程序性死亡，涉及细胞凋亡、自噬样细胞死亡、细胞坏死死亡等多种类型[3]。病因学研究表明，在所有PD中，遗传因素所致的家族性PD仅占10%，而环境因素诱发的散发性PD约占90%[4]。百草枯可通过血脑屏障到达黑质纹状体系统，流行病学和毒理学的研究证明，百草枯的低水平持续暴露可选择性地破坏黑质纹状体系统，诱发神经细胞程序性死亡，导致PD，但其机制尚不明确[5]。现就百草枯暴露致PD神经细胞程序性死亡机制的研究进展予以综述。

1 细胞凋亡

凋亡是多基因严格控制的细胞自主有序死亡的主动过程，可维持机体内环境的稳定，以效应分子胱天蛋白酶(caspase)的激活为主要特征。PD的发生发展与神经细胞的凋亡有关[6]。有证据表明，PD患者黑质内的神经细胞凋亡被过度激活[7]。诱导细胞凋亡的途径主要有死亡受体途径、线粒体信号途径和内质网信号途径以及穿孔素/颗粒酶凋亡信号通路等[8]。

1.1死亡受体途径 死亡受体途径是胞外信号诱导的细胞凋亡途径，也称外源性凋亡途径。凋亡相关因子(factor associated suicide，Fas)和死亡受体4/5通过与其对应Fas配体和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体结合而被激活，然后通过死亡结构域结合到Fas相关死亡结构域蛋白，后者的死亡效应器结构域与死亡受体8/10结合，形成死亡诱导信号复合物，促进死亡受体8/10的自我保护性裂解，从而诱导caspase级联激活，最终导致细胞凋亡[9-11]。

百草枯诱导的PD发生发展过程中的死亡受体途径被激活[12-13]。PD小鼠黑质纹状体中Fas配体和caspase-3的含量上升，在百草枯诱导的小鼠PD模型中，CD4+T细胞通过高表达多巴胺能细胞Fas配体，导致多巴胺能细胞凋亡。在神经元中，Fas诱导的凋亡可被Fas凋亡抑制分子2(Fas-apoptotic inhibitory molecule 2，Faim2)阻止。对中风和细菌性脑膜炎动物模型的研究发现，Faim2缺陷小鼠发生神经退行性病变的概率升高，与非Faim2野生型缺陷小鼠相比，未经处理Faim2缺陷小鼠的多巴胺能系统无明显变化；Faim2缺陷组经除草剂处理的黑质外侧多巴胺能神经元数量减少更明显；Faim2缺陷组背纹状体和腹纹状体多巴胺能纤维密度降低更明显；经除草剂处理后的野生型非Faim2缺陷小鼠的Fas凋亡抑制分子2的表达下降[14-15]。综上所述，Faim2缺陷的多巴胺能神经元的变性增加，表明Fas诱导的凋亡可导致PD，而上调Faim2有助于保护神经，提示Fas凋亡通路参与了百草枯诱导的多巴胺能神经元死亡。LRRK2突变是PD最常见的遗传原因。Ho等[16]提出了富亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)激活死亡受体途径的另一机制。LRRK2含有一个功能性激酶域，最常见的LRRK2致病性突变G2019s可提高LRRK2的活性。LRRK2可调节神经元线粒体的形态和自噬，经脂多糖处理后可增加小胶质细胞中LRRK2的水平，并促进线粒体分裂；下调或抑制LRRK2的活性可减弱小胶质细胞的活化。LRRK2可以激酶依赖的方式，通过选择性动态蛋白相关蛋白1促进小胶质线粒体的改变，从而刺激促炎反应。活跃的小胶质细胞引起的神经炎症是局部放电的主要症状，可能成为局部放电治疗的潜在目标。

1.2线粒体信号途径 线粒体通路又称内源性凋亡途径，由一系列刺激物(包括DNA损伤和生长因子撤退)诱导，在细胞应激反应中被激活，应激信号包括DNA损伤、活性氧类(reactive oxygen species，ROS)及脂质过氧化等，可最终触发线粒体外膜通透性的改变，其中线粒体外膜通透性的改变通常是某些凋亡前Bcl-2家族成员活化的结果[17]。

线粒体功能障碍导致细胞色素C释放到细胞质，并与凋亡蛋白酶激活因子1结合形成多聚体，激活caspase-9，进而激活caspase-3等，并使caspase-9和caspase-3等表达增加，而抗凋亡基因表达减少，继以激活DNA断裂因子，导致静息状态的核酸内切酶活化，最终引起DNA断裂和细胞凋亡[18]。线粒体外膜通透性的改变由Bcl-2家族成员调节，在线粒体信号途径中起关键作用。Bax和Bak蛋白被激活后，通过线粒体外膜形成孔刺激线粒体外膜通透性的改变和细胞色素C的释放[19]。

内源性凋亡途径还包括由凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)介导的凋亡途径，是一种非caspase依赖的凋亡途径[20]。AIF是一种系统发育保守的线粒体膜间黄素蛋白，细胞接收特异性凋亡诱导信号，触发线粒体通透性转换孔的开放，并允许AIF从线粒体释放到胞质中，随后AIF与亲环素A形成复合物，易位到细胞核，作用于核DNA，影响DNA碎裂，诱导色素溶解和细胞凋亡[21]。除非caspase依赖的凋亡途径外，AIF还可与细胞色素C以及caspase相互作用，表明不同凋亡途径可相互交叉调节，激活凋亡程序。

Zhao等[22]发现，百草枯可导致ROS过度生成、细胞色素C释放增多、线粒体破坏以及细胞凋亡。激活抗氧化途径可以保护小鼠免受百草枯诱导的氧化应激损伤，使用选择性动态蛋白相关蛋白1抑制剂抑制线粒体分裂可显著减弱百草枯诱导的细胞凋亡，可见，线粒体裂变涉及百草枯诱导的细胞凋亡；进一步研究表明，抗氧化剂抗坏血酸可抑制选择性动态蛋白相关蛋白1线粒体移位和线粒体裂变，并减弱百草枯诱导的细胞凋亡。Han等[23]的研究证实，百草枯可诱导AIF水平升高，介导细胞凋亡，其作用呈剂量依赖方式，且甜菜碱具有抗氧化和抗炎作用，可减轻百草枯诱导的氧化应激，对百草枯引起的细胞凋亡有保护作用。细胞色素C参与α-突触核蛋白(α-Synuclein，α-syn)自由基形成和寡聚化，表明α-syn参与了蛋白质自由基的形成、生物途径的改变以及多巴胺能神经元的凋亡。有研究发现，慢性百草枯暴露6周的野生型小鼠的凋亡标志物上调，而PD的典型特征是缓慢的、进行性的神经元凋亡，因此细胞色素C和α-syn介导的累积损伤和延迟凋亡过程更有意义，而α-syn敲除小鼠在长期慢性百草枯接触后神经元凋亡和纹状体多巴胺的丢失均减少[24]。

1.3内质网信号途径 内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途径也是内源性凋亡信号通路。内质网是真核细胞的重要细胞器，是蛋白质合成、修饰和转运到高尔基体的场所。葡萄糖缺乏、缺氧、钙失衡和氧化应激导致ERS中未折叠或错误折叠的蛋白质积累，严重时可诱导细胞凋亡[25]。ERS主要通过肌醇需求酶1、双链依赖的蛋白激酶R样内质网激酶和转录激活因子6三种信号传递因子激活级联反应，诱导细胞凋亡[26]。以上三种信号传递因子可与免疫球蛋白结合蛋白/葡萄糖调节蛋白78在内质网膜上组成稳定的混合物，而免疫球蛋白结合蛋白/葡萄糖调节蛋白78表达过强则可通过调节Bcl-2家族引起细胞凋亡。此外，当ERS激活c-Jun氨基端激酶时，ROS和Ca2+可通过ERS导致细胞凋亡，被认为是两种凋亡途径的交叉[27]。百草枯中毒时，ERS与氧化应激、炎症反应和细胞凋亡有关[28]。Li等[29]的研究发现，百草枯中毒第7天大鼠海马葡萄糖调节蛋白78、caspase-3及C/EBP同源蛋白水平明显上升，细胞凋亡也明显增加，表明百草枯可诱导中毒大鼠脑组织ERS，调控失败时导致细胞凋亡，最终导致脑损伤。乌司他丁通过抑制各种酶的活性、清除氧自由基和改善微循环，减轻ERS，抑制caspase-3的表达，进而抑制ERS介导的细胞凋亡，从而发挥其神经保护作用。

1.4穿孔素/颗粒酶凋亡信号通路 穿孔素和颗粒酶都来自细胞毒淋巴细胞和自然杀伤细胞，具有清除病毒感染和(或)癌细胞的能力。穿孔蛋白和促凋亡丝氨酸蛋白酶储存在细胞毒性分泌颗粒中，与靶细胞形成免疫突触后，由细胞毒淋巴细胞释放到突触裂隙，穿孔素单体通过Ca2+依赖的C2结构域和寡聚酶与靶细胞膜结合，在靶细胞膜上形成跨膜孔。跨膜孔允许颗粒酶被动扩散到靶细胞，引起caspase的激活，导致靶细胞DNA降解及凋亡[30]。穿孔蛋白基因突变或对穿孔蛋白分泌至关重要的基因突变，导致细胞毒淋巴细胞未能传递功能性穿孔蛋白，造成致命的免疫调节疾病和(或)癌症的发生。

神经元特异性T细胞可能进入中枢神经系统，引起神经变性，导致PD。Puentes等[31]对自身免疫介导小鼠神经变性的研究发现，震颤和肌强直小鼠病变区域内CD4+T细胞显著增多，免疫反应性增强，颗粒酶和穿孔素升高，表明穿孔素/颗粒酶信号通路可导致神经元细胞凋亡。百草枯可导致炎症因子改变和免疫激活，但尚无颗粒酶和穿孔素改变的相关研究。

2 自噬样细胞死亡

自噬是细胞将自身细胞质蛋白或细胞器包被进入囊泡，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新过程，与细胞凋亡有复杂的相互作用。凋亡和自噬性细胞死亡之间的界限并不完全清楚。细胞凋亡可能以自噬开始，自噬通常以细胞凋亡结束，抑制或阻断caspase活性可能导致细胞从凋亡转为自噬性细胞死亡。自噬的激活可反映自噬过程和凋亡过程之间的相互作用。自噬可由许多最终导致细胞凋亡的应激反应诱导，如细胞器功能障碍、代谢应激、细胞萎缩、病原体感染以及饥饿。若相关应激反应诱因得到解决，细胞通常会恢复体内平衡，并恢复初始状态。若应激反应诱因持续存在，自噬则不能维持细胞存活，细胞可通过激活凋亡途径做出反应，以确保有效地控制和消除细胞，而不引发局部炎症。细胞凋亡和自噬之间具有复杂的相互作用，并在细胞死亡所致神经退行性疾病(如PD)的发生发展中起重要作用，为PD等疾病的治疗提供了新的思路[32]。

尸检证据和实验模型表明，自噬参与神经变性和α-syn-路易小体的形成，此过程与LRRK2的参与有关。LRRK2可促进自噬的发生和自噬体的形成，并损伤自噬降解过程，导致自噬功能障碍以及α-syn清除障碍，还可通过自噬激酶和鸟苷三磷酸酶调节自噬，从而影响线粒体自噬和自噬调节分子，造成细胞毒性，参与多巴胺能神经元变性死亡过程[33]。

研究证实，PD患者黑质纹状体系统α-syn聚集、路易小体出现以及多巴胺能神经元缺失[5]。PD相关蛋白α-syn、LRRK2、DJ-1蛋白、Parkin蛋白、磷酸酶和张力蛋白同源蛋白诱导的激酶1均参与调节自噬，而1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶、6-羟基多巴、鱼藤酮和百草枯等均可导致细胞内自噬体增加。Redmann等[34]将小鼠神经元暴露于α-syn预形成纤维的研究发现，内源性α-syn聚集，进而出现神经细胞死亡。PD病变区域可观察到神经元自噬的过度激活以及星形胶质细胞的自噬障碍共存。百草枯可通过ERS触发神经元自噬激活，激活凋亡信号调节激酶1及促分裂原活化的蛋白激酶家族成员；此外，低浓度百草枯可引起星形胶质细胞的自噬损伤或功能障碍，由于细胞质内含物的清除不足和线粒体功能障碍，自噬的抑制加速了百草枯诱导的细胞凋亡，最终导致细胞丢失[5]。星形胶质细胞是神经毒素的第一靶点，强大的抗氧化机制使其成为大脑的第一道防线。长期暴露于百草枯可减少星形胶质细胞的基础自噬，此效应具有剂量依赖性，并可发生非致死浓度的百草枯中毒。共培养实验表明，星形胶质细胞自噬的损伤限制了其保护多巴胺能神经元的能力，且具有时间和剂量依赖性[35]。百草枯还可通过减少自噬空泡的生成阻断自噬，其对星形胶质细胞U33细胞和原代星形胶质细胞自噬的抑制由氧化应激介导，且抑制作用并不局限于基础自噬。此外，百草枯还触发了其上游的亲自噬信号。

3 细胞坏死死亡通路

3.1坏死性凋亡 坏死性凋亡是指由死亡受体配基启动、通过死亡受体介导的细胞坏死，不涉及caspase等效应分子，并可被坏死抑素-1特异性阻断。坏死性凋亡是调节坏死细胞死亡的一种形式，通过激活受体交互作用蛋白1和受体交互作用蛋白3来执行，后者在细胞凋亡不足的情况下被激活[36-37]。坏死性凋亡可由多种刺激引起，但对死亡受体介导的激活，特别是肿瘤坏死因子受体1介导的激活的研究最广泛。在分子水平上，坏死性凋亡包括受体交互作用蛋白1和受体交互作用蛋白3的自磷酸化和反磷酸化，导致形成淀粉样多蛋白复合物，即坏死体。此外，混合谱系激酶域样假激酶由受体交互作用蛋白3招募和磷酸化，并参与坏死性凋亡的过程，磷酸化后的混合谱系激酶域样寡聚并迁移到细胞膜，导致坏死膜破裂和细胞坏死性凋亡[38]。

有证据表明，坏死性凋亡可促进PD的进一步细胞死亡和神经炎症。在PD中，坏死抑素-1能阻断细胞坏死并保护多巴胺能神经元。将6-羟多巴胺诱导的PC12细胞作为PD模型的研究发现，6-羟多巴胺诱导的PC12细胞的线粒体存在功能障碍，坏死抑素-1可增加PC12细胞的活力，稳定线粒体膜电位，但当坏死抑素-1浓度为60 μmol/L和90 μmol/L时，PC12细胞的存活率下降，表明坏死抑素-1对PC12细胞具有双重作用，低浓度坏死抑素-1对PC12细胞具有保护作用，而高浓度坏死抑素-1对PC12细胞具有毒性[39]。由此可见，对坏死抑素-1的检测有助于了解PD中坏死抑素-1的作用机制，但目前坏死抑素-1在百草枯致PD中的保护作用机制尚不清楚。

3.2细胞急性坏死 细胞急性坏死所致细胞程序性死亡中，损伤Na+/K+-ATP酶致细胞内钠超载及线粒体损伤相关的分子模式作为关键事件产生的线粒体DNA泄漏，可诱导急性细胞坏死，并介导炎症反应[40]。细胞急性坏死所致细胞程序性死亡与线粒体损伤有关，且线粒体损伤导致的细胞急性坏死在神经退行性变(如PD)中至关重要。Bir等[41]发现，α-syn积累可致线粒体功能障碍和细胞急性坏死，在PD的发病机制中具有重要意义，而下调α-syn 的表达可以防止乳曲霉素所致SHSY5Y细胞线粒体功能障碍和细胞急性坏死，此外，野生型α-syn 的过表达对氧自由基暴露具有保护作用，但尚未发现对百草枯暴露的保护作用。

3.3聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)-1依赖性程序性死亡 PARP-1依赖性程序性死亡是一类由PARP-1介导的不依赖caspase的细胞死亡，其机制明显依赖于线粒体相关AIF的核易位，此种核易位由PARP-1过度活化引起，可引发大规模的DNA断裂和染色质浓缩，最终导致细胞死亡[42-43]。PARP-1过度激活还导致大量聚ADP核糖合成并在细胞内积聚，细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和ATP耗竭。聚ADP核糖可导致线粒体内AIF释放，并促进AIF进入细胞核，诱导细胞死亡，其特征为大规模DNA片段化和染色质缩合[44]。PD患者的中脑聚ADP核糖明显升高，表明PD患者中脑PARP存在过度激活。对PD小鼠模型的研究表明，PARP-1依赖性程序性死亡在缓慢进展的多巴胺能神经元变性中占主导地位，而百草枯暴露导致细胞内Ca2+内流和线粒体功能障碍，进而激活一氧化氮合酶，使一氧化氮产生氧亚硝基阴离子，导致PARP-1的过度激活、DNA损伤及神经元PARP-1依赖性程序性死亡[45]。PARP表达下降或活性抑制能抑制小鼠黑质多巴胺能神经元发生PARP-1依赖性程序性死亡。Tuncer等[46]的实验证实，百草枯可致PARP的过度激活，而百草枯暴露后使用PARP抑制剂有助于降低百草枯的毒性。

3.4铁死亡 铁死亡主要是细胞内脂质ROS生成与降解的平衡失调，引起铁依赖性脂质ROS的堆积。当细胞抗氧化能力降低，脂质ROS堆积，即可引起细胞氧化性死亡，即铁死亡。铁死亡可以被多种化合物所诱导，其上游通路均通过直接或间接影响谷胱甘肽过氧化物酶的活性降低细胞的抗氧化能力，致使脂质过氧化反应增加，ROS增多，引起铁死亡。铁是铁死亡过程的必要条件，各种铁螯合剂均能抑制细胞的铁死亡；相反，补充铁离子可以加速铁死亡。铁离子在细胞铁死亡中的确切作用至今仍不明确，可能与电子传递以及ROS的生成有关[47]。

研究表明，PD的发病与铁死亡和ROS相关[48-49]。PD中存在铁积累和脂质过氧化，并伴随谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶4的减少，铁的沉积加剧了谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶4的减少，而铁抑制素-1、利血抑制素-1和内源性维生素E等自由基清除剂则可防止谷胱甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶4的减少。铁中毒终止于线粒体功能障碍和毒性脂质过氧化，两者均在PD的发生发展中起重要作用。另有研究发现，铁死亡抑制因子(如利乐司他丁)可以保护神经元，恢复动物模型的认知功能[50]。铁死亡抑制剂可以有效地抑制百草枯诱导的SH-SY5Y细胞死亡。百草枯接触前注射铁死亡抑制剂至小鼠脑内可以减轻因百草枯毒性导致的黑质多巴胺能神经元的丢失[50]。

4 小 结

百草枯可通过激活死亡受体途径、线粒体信号途径及内质网信号途径等促进细胞凋亡，神经元自噬的过度激活加速了百草枯诱导的细胞凋亡，而星形胶质细胞的自噬障碍限制了其保护多巴胺能神经元的能力，坏死性凋亡、细胞急性坏死及铁死亡等均参与了百草枯致PD的程序性死亡的发生发展。对百草枯致PD程序性死亡的进一步研究将为PD的治疗提供新靶点和理论依据，为降低PD发病率、改善PD诊疗现状、提高PD患者的生活质量、改善患者预后提供帮助。