自噬在胶质母细胞瘤中的研究进展

赵海杞，赵世光，石长滨，张欣健，韩大勇，滕 雷

(哈尔滨医科大学附属第一医院神经外一科，哈尔滨 150001)

自噬在细菌和病毒感染[1]、抑制炎症反应、适应性免疫反应和免疫监视以及神经退行性变、心脏病、肿瘤等方面发挥着重要作用[2]。自噬活动异常是一个新发现的肿瘤特征，与肿瘤的发生、生存和治疗有关[3]。一般而言，自噬能够通过清除废物和管理合成及分解代谢的有毒副产品(如活性氧)减轻细胞在代谢和治疗方面的压力[4]。胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是一种侵袭性强，恶性程度最高的星形细胞肿瘤，是儿童和成人癌症相关死亡的主要原因之一。自噬具有双重功能，少量的自噬可以增加GBM细胞的耐药性，过量的自噬则可以通过自噬性死亡杀伤肿瘤细胞[5]。在GBM中,替莫唑胺(temozolomide，TMZ)诱导的自噬作用被认为是TMZ作用于肿瘤细胞的机制。合理利用自噬在GBM中的作用机制，将有助于有效利用自噬来治疗GBM。现对自噬在GBM发生、发展中的作用及在新型靶向治疗领域的相关前景进行综述。

1 自 噬

1.1自噬的概念 自噬是一种保守的进化过程，细胞通过降解和循环细胞质成分以供细胞再利用[6]。自噬是泛素-蛋白酶体系统的补充，参与大多数蛋白质和细胞器(如线粒体、高尔基复合体和内质网)的降解和再循环[7]。在健康细胞中，自噬通常处于基础水平，是维持细胞质质量控制和细胞内稳态所必需的[8]。在某些细胞环境中，特别是当细胞凋亡有缺陷时，自噬则可以介导第二种形式的程序性细胞死亡，即自噬性死亡，或者自噬性死亡与凋亡同时发生。自噬是一个多步骤的过程。首先，自噬从形成来源于内质网或线粒体的分离膜开始[9]。分离膜将逐渐囊括部分细胞质，形成一个双膜自噬体。然后，双膜自噬体会与溶酶体融合形成自溶体，自溶体可以被溶酶体水解酶降解。最后，降解得到的大分子会被输送到胞质中被各种代谢回路重复使用。在此过程中，微管相关蛋白LC3-Ⅰ会与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-磷脂酰乙醇胺共轭物。因此，在体外和体内，LC3-磷脂酰乙醇胺共轭物的增加通常被当作自噬诱导产生的指标。通过对酵母进行遗传分析发现了大量的进化保守基因，即自噬相关基因(autophagy-related gene，Atg)，负责调控自噬体形成的顺序-即自噬体膜的起始、成泡和扩展。根据定位于吞噬细胞组装位点的核心Atg在自噬发生中的不同功能作用，可分为不同的类群，包括：UNC-51样激酶1复合体；胞内磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)复合体；Atg 9循环系统和Atg 8/微管相关蛋白LC3泛素样共轭系统等[10]。

1.2自噬的调节机制 自噬起始主要由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)控制，作用方式是阻断UNC-51样激酶1复合体的活性，从而阻止形成自噬体所需的第一步[11]。mTOR有两种结构不同的复合物，即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物(mammalian target of rapamycin complex,mTORC)1和 mTORC2，两者虽然具有共同的组成成分，但细胞功能并不相同。mTORC1被认为是自噬的主负调节因子[12]。mTOR1的活性由高营养水平、高能量利用率、氧含量正常等多方面因素来维持[13]。随着这些因素在细胞应激条件下被削弱，自噬体的生成会明显增加。这些因素主要在mTORC1和mTORC2的复合体上调节这一过程。例如，5′-腺苷酸依赖的蛋白激酶能够磷酸化mTORC2，该激酶在低腺苷三磷酸水平下被激活，导致mTORC1和mTORC2复合体的激活，抑制了mTORC1的活性，并进一步诱导自噬[14]。PI3K信号通路是在生长因子刺激受体酪氨酸激酶后激活的，也可以直接磷酸化mTORC2，伴随mTORC1活性激活，抑制自噬[15]。很多信号通路和关键细胞蛋白也参与了自噬的调控，包括真核延伸因子-2激酶、应激活化蛋白激酶、核因子κB信号通路等。例如，真核延伸因子-2激酶在调节多个细胞应激(包括内质网应激和氨基酸饥饿)时的自噬中发挥重要作用。应激活化蛋白激酶参与了几种刺激自噬诱导的途径，包括内质网应激和肿瘤坏死因子-α引起的应激。此外，应激活化蛋白激酶信号还参与了自噬性细胞死亡和各种Atg表达的调控。研究表明，核因子κB信号通路抑制也是自噬细胞死亡的必要条件[16]。总之，自噬是一个复杂的调控过程，包括了大量的相关调节因子。而这些调节因子多为抑癌蛋白或癌基因。因此，与自噬调控有关的通路和与肿瘤相关的信号通路很大程度上是重叠的。

2 自噬在GBM发生发展中的作用

2.1GBM中自噬的发生 GBM是一种侵袭性星形细胞肿瘤。GBM患者的中位生存期为最初诊断后的12～15个月。对新诊断的GBM患者的常规治疗方法包括手术切除肿瘤、放疗和化疗。虽然这些治疗方法已将生存率提高到14.6个月，但生存优势仅为姑息性[17]。自噬可能阻止或抑制GBM发生。在原发的人乳腺癌中存在自噬相关蛋白 Beclin 1的单等位基因缺失，而Beclin 1杂合子缺失与小鼠自发肿瘤的高发生率有关。因此，Beclin 1在肿瘤中的缺失支持了自噬在本病的发生中起抑制作用的理论。与低级别星形细胞瘤和正常脑组织相比，GBM细胞中自噬相关蛋白Beclin 1与LC3b-Ⅱ水平降低，提示自噬活性降低可能导致GBM向更加恶性的方向发展[18]。GBM细胞胞质中Beclin 1的高水平与细胞凋亡呈正相关，与细胞增殖呈负相关。有报道表明，高Beclin 1水平的GBM患者治疗后表现的状态，对治疗的客观反应率较高，疾病短期无进展，且总体生存率较高[19]。

2.2GBM中自噬的调节与功能 自噬的调节是由信号通路控制的，这些信号通路也调节GBM的发生、发展。自噬调节基因Atg4C、Atg5以及Beclin 1的表达缺乏以及PIK3-蛋白激酶B-mTOR信号通路的下调伴随着GBM的发展[20]。辛二酰苯胺异羟肟酸是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可以改变染色质结构，从而调节DNA损伤修复[21]。辛二酰苯胺异羟肟酸可以通过下调PIK3-蛋白激酶B-mTOR信号通路来诱导自噬，进一步通过细胞凋亡来促进GBM干细胞的死亡[22]。因此，可调节自噬相关信号通路的化学物质，在GBM中具有治疗潜力。自噬在肿瘤中具有双重功能，在肿瘤发生的早期阶段，会限制细胞的增殖，造成DNA的损伤，从而限制肿瘤的进展。当肿瘤体积增大时，其血液供应受到限制，自噬可促进缺乏营养和缺氧的肿瘤区域内肿瘤细胞的存活[23]。当考虑治疗耐药性时，经典化疗和自噬调节之间的相互作用是复杂的。已有研究者提出，自噬可能导致肿瘤细存活或细胞死亡，但取决于细胞的环境[24]。一方面，TMZ诱导的自噬作用似乎具有细胞保护作用。TMZ急性治疗时可持续抑制类雷帕霉素靶蛋白，产生短暂的自噬作用，导致治疗的细胞耐药性。另一方面，自噬可以增强TMZ对GBM细胞的杀伤作用，研究发现TMZ与沙利度胺联合作用增强了TMZ对GBM细胞的细胞毒性，沙利度胺被认为是一种影响PI3K信号通路的药物，具有调节自噬的作用[25]。自噬对GBM的侵袭和抑制具有双重的调节作用。

2.3GBM中自噬的研究进展 最近根据基因表达预测将GBM分为4种分子亚型(经典型、间充质型、前神经型和神经型)[26]，更多的证据表明，自噬与这种分型高度相关。例如，经典型的GBM的特点是表皮生长因子受体水平异常增高，而神经纤维瘤蛋白-1(neurofibromin 1，NF1)几乎没有变化；表皮生长因子受体的这种扩增可以通过维持细胞内的基本葡萄糖水平抑制自噬[27]。表皮生长因子受体的扩增还会导致PI3K信号通路下游出现异常信号，进而促进肿瘤细胞的存活、生长、运动和侵袭，以及血管生成[28]。可见，表皮生长因子受体低表达和Beclin 1 高表达可作为GBM预后较好的生物标志。NF1和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因突变频率最高。上述结果表明，人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因通过抑制PI3K信号通路而上调自噬，而NF1是大鼠肉瘤蛋白的拮抗剂和类雷帕霉素靶蛋白的负调节因子，因此人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因和NF1的共突变也与PI3K-蛋白激酶B-mTOR通路的激活和自噬抑制有关。有研究在间充质型GBM中发现了较高水平的自噬底物蛋白p62，自噬底物蛋白p62积聚可以帮助解释与此亚型相关的侵袭性[29]。在不同的GBM分子亚型中发现了微管相关蛋白LC3的不同基础表达水平，这凸显了自噬在亚型特异性GBM的发生和发展中的潜在意义。然而，为了更好地理解自噬在GBM中的相关性，需要对不同GBM亚型中自噬调节因子的表达进行更详细的分析。反过来，这也可能有助于发展基于自噬的治疗方法，从而提高目前治疗标准的有效性。

3 自噬在GBM治疗中的作用

在GBM中,TMZ诱导的自噬作用被认为是TMZ作用于肿瘤细胞的机制[30]。TMZ是一种烷基化咪唑四嗪，是GBM化疗的主要药物，在O6位将基因组DNA中的鸟嘌呤甲基化，使得下一个复制周期中，甲基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶不匹配。G：T错配可以通过DNA错配修复，甲基化鸟嘌呤也可以被O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶直接去甲基化，从DNA中去除甲基，与其残基结合。许多胶质瘤细胞系和原代胶质瘤细胞均为O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶缺陷[31]。因此，这些DNA修复系统的功能对于TMZ的疗效耐药性具有重要意义[20]。如果DNA损伤的程度超过了细胞修复的能力，细胞就会被阻滞在细胞周期检查点，通常是G1/S或G2/M期，并给予完全修复DNA损伤所需的额外时间。如果这种情况下降，该细胞可以激活程序性死亡途径或停止细胞分裂。不同的情况是可能的，这取决于许多因素，包括未修复的DNA损伤的程度和当前的细胞状况。因此，TMZ的抗癌作用机制是多种机制的结合。TMZ是治疗GBM最有效的药物，然而，疗效往往受肿瘤复发和对TMZ耐药性的影响。研究表明，抑制诱导TMZ耐药性产生的保护性自噬能够治疗GBM。例如，自噬抑制因子，如氯喹及其类似物，已应用于治疗TMZ的临床试验中[32]。但另一研究表明，TMZ也可以通过触发自噬性死亡提高治疗效果。敲低PI3K通路，可以通过进一步上调自噬，阻滞细胞周期发生，提高TG98 GBM细胞系对TMZ的敏感性[33]。Stojcheva等[33]也证明，使用凋亡抑制剂BIM通过靶向敲低微RNA-138，增强胶质瘤细胞的自噬性反应，可以抑制质瘤细胞对TMZ的耐药。

4 小 结

自噬的双重作用主要取决于肿瘤的类型及微环境。GBM术后应用TMZ治疗能够激活自噬产生TMZ耐药，然而当通过调节信号通路使自噬反应进一步加剧时，自噬会诱导GBM细胞发生凋亡，该发现为耐药性GBM的治疗方案的发现打开了新思路。鉴于GBM的高度异质性。针对未来GBM的治疗方法可能更多针对GBM的不同分子亚型。在包括GBM在内的各种癌症中，自噬的关键作用发现较晚。自噬在GBM中发挥的作用复杂，进一步研究自噬的多重信号通路以及发现新的信号通路并在其基础上研究新的治疗方案可能成为GBM研究领域的新重点。