长链非编码RNAs及其相关信号通路在结直肠癌中的作用

孙希珍，龙思丹，姚树坤,※

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 中日友好医院消化内科，北京 100029； 2.北京中医药大学，北京 100029)

结直肠癌是全球范围内发病率极高的恶性肿瘤，在肿瘤相关性死亡中排第二位[1]。来自我国177个癌症登记处覆盖1.75亿人口的大数据分析表明，2011年中国所有癌症的5年患病率约为749/10万，其中结直肠癌的发病率约为58.3/10万，且城市高于农村[2]。目前，临床结直肠癌治疗以手术切除联合放化疗为主，由于肿瘤的转移和复发是结直肠癌治疗失败的主要原因[3]，故阐明结直肠癌进展及转移的分子机制显得尤为重要。长链非编码RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)由于不能直接编码蛋白质一直被忽略，随着研究的深入，人们意识到lncRNAs具有一定的生物学功能，可能参与了肿瘤的发生[4]。lncRNAs是指长度大于200个核苷酸的重要转录RNA分子[5]。随着全基因组测序技术的发展，lncRNAs的研究越来越受关注。这些lncRNAs与DNA、RNA、蛋白质分子相互作用，作为DNA转录和转录后调节的必需调节剂[6]。文献报道，lncRNAs参与了结直肠癌的转移，在上皮-间充质转化，血管的生成、侵袭、迁移和增殖等过程中均发挥作用[7]。现就lncRNAs及其相关信号通路在结直肠癌中的作用予以综述。

1 lncRNAs概述

lncRNAs是一类不具有编码蛋白质功能的长链RNA，在2002年小鼠全基因组互补DNA文库的大规模测序过程中首次发现[8]。与其他非编码RNA[微RNA(microRNA，miRNA)、核小RNA、环状RNA]不同，lncRNAs包含更多的核苷酸，且具有更复杂的二维三维空间结构，因此lncRNAs除了与其他RNA(包括编码RNA、非编码RNA)、DNA相互作用外，还能通过改变自身的空间结构发挥调控作用[9-10]。据统计，人类转录组中至少有91 000个基因共编码约58 000个lncRNAs，其中3 900个lncRNAs 与疾病相关基因有重叠[11]。虽然根据定义lncRNAs 因没有编码蛋白质的开放阅读框架不能编码蛋白质，但是非编码转录组的真实维度和复杂性仍然未知，随着转录组测序深度和质量的进展，研究发现一些新的lncRNAs被发现能编码一些短片段多肽的lncRNAs[12]。目前，根据lncRNAs的亚细胞定位、与相邻或同源蛋白编码基因的关系、与其他大分子的相互作用及其生物学功能，lncRNAs可分为不同类型。基于lncRNAs之间及其与相邻或同源性蛋白编码基因的关系，lncRNAs可分为发散和收敛型、内含子型(lncRNAs从另一个基因的内含子转录而来)、基因间型、重叠和反义重叠型、增强子RNA型、miRNA宿主基因型6种[13]。虽然与编码蛋白质的基因相比，lncRNAs的表达量较低，但是其生物学功能十分重要[14]。

研究表明，lncRNAs参与了多种生物过程，如基因组印迹、表观遗传、转录调控、染色体构象、细胞周期调控、干细胞分化和变构酶活性的变化[15]。lncRNAs 能与蛋白质、RNA、DNA相结合，形成功能复合体，在多种细胞过程中发挥重要的生物学作用[16-17]。在细胞核内，lncRNAs可以通过与各种转录因子、染色质修饰因子、异质性胞核核糖蛋白结合调控基因的表达[18]。同时作为转录辅助激活因子，影响DNA甲基化或组蛋白修饰的lncRNAs，也可以在转录后水平通过影响信使RNA的加工、剪接、翻译等过程调节基因的表达。在细胞质中，lncRNAs可作为内源性miRNA参与基因的表达调控[19-20]。Zhang等[21]研究发现，lncRNAs可作为癌基因或抑癌基因在肿瘤的发生中发挥作用，在膀胱癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌等常见恶性肿瘤中通过上调或下调相关基因的表达发挥调控作用，故lncRNAs 有望成为新的肿瘤诊疗靶点。

2 lncRNAs与结直肠癌

lncRNAs不仅参与了结直肠癌细胞的增殖及肿瘤的转移，还与结直肠癌的预后密切相关[22]。lncRNAs主要通过直接作用于编码RNA或通过参与不同的信号通路，调节靶基因的表达来发挥作用。结直肠癌相关lncRNA (colorectal cancer-associated lncRNA，CCAL)是结直肠癌进展的关键调控因子。研究表明，与CCAL表达少的肿瘤患者相比，CCAL表达多的肿瘤患者总体生存期较短，对辅助化疗的反应较差[23]。CCAL通过作用于激活蛋白2α，进一步激活Wnt /β联蛋白(β-catenin)信号通路，从而促进肿瘤细胞的增殖。此外，CCAL还可以通过上调多药耐药基因1/P-gp激活Wnt /β-catenin信号通路诱导结肠癌细胞多药耐药性的产生[23]。现分别介绍参与结直肠癌发生、转移的lncRNAs及相关信号通路。

2.1与结直肠癌相关的常见lncRNAs 与正常肠黏组织相比，多种lncRNAs在结直肠癌中的水平存在差异，可能参与结直肠癌的发生过程，如POU6F2-AS1、RAB6C-AS1、DDP10-AS1、HOXA11-AS、LINC00944 HE和FEZF1-AS1在结直肠癌肝转移中有重要作用[24]。其中，FEZF1-AS1能明显提高结直肠癌细胞的增殖、侵袭及转移能力[25]。随着全基因组测的发展，越来越多的lncRNAs被证明参与了结直肠癌的发病过程，目前研究较多的有以下几种。

2.1.1母系印迹表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3) MEG3位于人类染色体14q32.3处的DLK1-DIO3基因簇内，是一个富含印迹基因的位点，包含10个外显子，编码长约1.6 kb的非编码RNA[26]。MEG3是第一个能抑制肿瘤生长的lncRNA，此外还与糖尿病、组织纤维化等有关[27-28]。母系印迹表达基因的发现使非编码RNA的研究，尤其是lncRNAs与肿瘤之间关系的研究成为热点。如MEG3在多种类型的恶性肿瘤中存在表达异常的情况，包括胃癌、胰腺癌和前列腺癌等，相比正常组织其表达水平显著降低甚至完全缺失[29]。

MEG3的作用机制比较复杂，有数据表明，子宫内高血糖引起的MEG3水平升高可能是有益的，其可以减缓糖尿病、高脂血症等代谢疾病的进展[30]。进一步研究证明，在所有癌症病例中，20%的病例是由过量脂肪引起[31]。动物实验发现，成年猴子的适度热量控制可将癌症风险降低50%[32]。可见，MEG3可通过影响代谢抑制肿瘤的发展。另一方面MEG3通过几个独立的机制抑制癌症的发生，包括上调典型的肿瘤抑制因子p53、抑制血管生成和自噬抑制等。实时荧光定量聚合酶链反应检测结果显示，结直肠癌患者肿瘤组织中MEG3的表达量明显低于癌旁组织及正常组织，且与组织低分化、深部肿瘤浸润和晚期肿瘤淋巴结转移显著相关[33]。p53是结直肠癌中最重要的抑癌基因，研究表明，上调MEG3可显著诱导p53的表达，提高相应蛋白质水平，从而达到抑癌目的[34]。

有研究表明，MEG3可能通过miR-144发挥作用，MEG3和miR-144有相似的结合序列位点，两者之间可以相互作用，敲除MEG3后，miR-144表达水平升高，表明MEG3可以调控miR-144的表达，从而对下游蛋白通路激活产生影响[35]。此外，抑制MEG3表达后，细胞增殖及细胞迁移能力增强，MEG3及miR-144同时抑制后，增殖及迁移能力部分恢复，进一步证明了MEG3参与了结直肠癌的增殖与转移[35]。

2.1.2尿路上皮癌相关1(urothelial cancer associated 1, UCA1) UCA1基因与多种肿瘤的发生及转移有关，其位于第19号染色体编码3个外显子。UCA1于2006年首次被发现，逆转录聚合酶链反应检测证实，UCA1在膀胱癌组织中的表达高于癌旁正常组织[36]。UCA1有1.4 kb、2.2 kb和2.7 kb 3种转录本，其中研究最广泛的为1.4 kb转录本[37]。UCA1与多种致癌途径有关，其中对肿瘤增殖转移的影响可能是通过阻断BRG1(brahma related gene 1)与细胞周期抑制因子p21和p27的启动子区域结合发挥作用[38]。此外，UCA1通过影响Wnt6表达增强肿瘤对抗癌药物的耐药性。在结肠癌细胞系中，UCA1可通过竞争性结合miR-143促进鼠类肉瘤病毒癌基因表达，从而促进结肠癌细胞的增殖与侵袭[39]。抑制UCA1表达可使细胞周期阻滞在G0/G1期，细胞周期由G1期进入S期依赖于转录因子E2F的激活，细胞周期蛋白依赖性激酶-细胞周期蛋白复合物磷酸化使得E2F从复合物中释放出来发挥作用，在这一过程中，UCA1可以促进细胞周期蛋白D1表达，并通过减少细胞周期蛋白依赖性激酶-细胞周期蛋白抑制剂的表达，从而使细胞周期蛋白依赖性激酶持续磷酸化，减少E2F的释放，进而加速细胞周期进程[40]。

此外研究发现，UCA1单独或与其他lncRNAs一起作为生物标志物诊断结直肠癌具有较高的特异性及敏感性，故具有一定的筛查价值[41]。

2.1.3结肠癌相关转录因子1(colon cancer associated transcript 1，CCAT1) CCAT1位于染色体8q24上，转录本长度为2 628 nt，是结直肠癌发生、发展中一条重要的lncRNA[42]。CCAT1有两种亚型，分别为短链的CCAT1-S和长链的CCAT1-L，其中CCAT1-L包含2个外显子和1个多聚腺苷酸结构，在结直肠癌和胃腺癌中均高表达，尤其是在细胞核中，CCAT1-L由位于MYC上游增强子转录而来，为结直肠癌特异性表达的lncRNA，而CCAT1-S可在多种肿瘤的细胞质中表达[43]。CCAT1在人结直肠癌组织中的表达量为正常人肠黏膜的235倍，在肿瘤发生各个时期均高表达，并与结直肠癌的转移相关[44]。CCAT1促进了MYC的转录与表达，从而进一步促进结直肠癌的发生。CCAT1低表达能减少MYC启动子和增强子之间的相互作用，抑制结直肠癌的进展[41]。CCAT1在结直肠癌中作用机制的相关研究越来越多，且临床已有数据表明，lncRNA-CCAT1 在区分结直肠癌患者和健康个体方面准确性很高[45]。

此外，CCAT1表达量的高低，在临床诊断方面有提示作用。有研究显示，CCAT1在结直肠癌阳性转移淋巴结患者中的表达水平高于结直肠癌阴性淋巴结及非肿瘤患者的良性淋巴结患者[46]。可见，CCAT1可能参与了结直肠癌淋巴结转移过程，作为诊断的生物标志物会进一步提高结直肠癌分期的准确性，从而有利于结直肠癌的精准治疗。

2.1.4HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR) HOX反义基因HOTAIR在第12号染色体上，位于HOXC11和HOXC12之间，全长约2.2 kb，于2007年首次发现[47]。研究表明，HOTAIR在乳腺癌、肝癌等人类癌症中的表达上调，可作为一种致癌基因，促进结肠癌细胞的增殖、转移及侵袭[48]。在人体中，HOTAIR 和p21的表达与淋巴结转移、肿瘤淋巴结转移、Dukes分期、远处转移、组织学类型和分化程度有关[47]。在结肠癌细胞系中，下调HOTAIR的表达可对细胞增殖、侵袭和迁移具有抑制作用，同时通过上调p21促进结直肠癌细胞的凋亡[49]。可见，HOTAIR可能通过上调p21促进结肠癌的发生。

2.1.5分化拮抗非编码RNA(differentiation antagonizing non-coding RNA，DANCR) DANCR位于人染色体4q12上，在多种肿瘤中扮演了类似癌基因的角色，最早于2012年由Kretz等[50]发现，起初被认为是表皮细胞去分化的关键，随后的研究逐渐转移到肿瘤相关性疾病。研究发现，DANCR参与了结直肠癌的增殖与转移，体外实验中过表达的DANCR可促进miR-577表达，进而促进结直肠癌细胞的增殖、转移、侵袭，而敲低DANCR可抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭及转移；在体内试验中，DANC0R的过表达促进了结直肠癌肿瘤生长和肝转移[51]。此外，DANCR可提高结肠癌细胞的侵袭能力，该作用可能与上调基质金属蛋白酶9表达有关[52]。

2.2lncRNAs与结直肠癌的耐药性和放疗敏感性 有学者通过对比结直肠癌亲本株与长春新碱耐药株中lncRNAs的表达谱发现，lncRNAs在耐药株中的表达谱发生明显变化：23种lncRNAs水平显著升高；20种lncRNAs水平显著降低[53]。同时，lncRNA snaR在结直肠癌5-氟尿嘧啶耐药株中的表达较少，过表达后可增加肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[54]。lncRNA MEG3在接受奥沙利铂治疗无应答的患者中表达下调，此外，接受奥沙利铂治疗的结直肠癌患者血清MEG3表达减少与化学反应差和存活率低有关[55]。且在结肠癌细胞系中，MEG3显著下调，增强了奥沙利铂诱导的结直肠癌细胞毒性[56]。可见，lncRNAs可在一定程度上提高肿瘤的化疗敏感性，逆转化疗耐药性。

2.3lncRNAs与调节结直肠癌发生及转移的相关信号通路

2.3.1Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin相关指标的高表达是结直肠癌的特征之一，研究表明，β-catenin作为转录因子与T细胞因子1和淋巴增强子结合因子1协同作用来激活下游靶基因[57]。Wnt 配体与受体卷曲蛋白或低密度脂蛋白受体相关蛋白结合会导致β-catenin复合体的解离，细胞质内的 β-catenin聚积后会向核内转移，并激活一系列肿瘤相关基因。研究表明，多种lncRNAs参与了Wnt/β-catenin信号通路，如CCAL[23]、CASC11[58]、CCAT2[59]、MALAT1[60]和lncRNA-p21[61]等。

2.3.2Janus激酶(Janus kinase，JAK)/信号转导及转录激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)信号通路 JAK和STAT是细胞因子信号传递中的重要分子，JAK 和 STAT除在免疫反应中有重要作用外，在肿瘤的起始阶段与进展阶段也有重要作用[62]。JAK/STAT信号通路的激活能够抑制细胞的凋亡，促进肿瘤的增殖与转移[63]。而lncRNAs主要通过调节该信号通路中的相关蛋白来调节肿瘤的发生发展。其中，在磷脂酰肌醇-3-激酶/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路中主要作用的lncRNAs有DUXAP10、RP11-708H21.4、lncRNA-422[64-66]。此外， PlncRNA-1通过调节磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B的磷酸化来发挥促癌作用[67]。

2.3.3促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路 研究表明，大多数人类癌症与生物分子事件Ras/MAPK信号通路的激活有关[68]。Ras/MAPK信号通路的激活能促进细胞的增殖、迁移和分化，在结直肠癌细胞中抑制这一信号通路能抑制肿瘤的发展[69]。lncRNA CRNDE在Ras/MAPK 信号通路的激活中有重要作用，而异质性胞核核糖蛋白UL2作为该信号通路的关键因子对CRNDE的稳定性有调节作用[70]。Wang等[71]的研究显示，MAPK/胞外信号调节激酶信号通路的激活受lncRNA NNT-AS1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase-antisense RNA1)的调节，且MAPK/胞外信号调节激酶信号通路的激活可以导致结直肠癌细胞上皮-间充质转化，加速细胞的增殖、侵袭、转移。

2.3.4p53信号通路 多种lncRNAs可通过p53信号通路影响结肠癌的发生、迁移、分化，从而间接影响患者治疗方式的选择及预后。调控转录因子p53是人类癌症中最常见的突变蛋白，是公认的抑癌基因。p53通过高表达诱导细胞周期阻滞、凋亡、自噬和衰老、抑制侵袭、迁移等发挥肿瘤抑制作用[72]。lncRNAs可影响p53的激活，如 PURPL、ROR、SNHG1、ZFAS1通过抑制p53的表达而发挥促肿瘤作用[73-76]。另外，HNF1A-AS1通过下调miR-34a/沉默信息调节因子1/p53信号通路参与结直肠癌的转移[77]。

2.3.5核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路 在人体中，NF-κB的生物活性功能相对较强，当细胞受到不同的因素刺激时，NF-κB将进一步激活，且能与人体中的靶基因相互结合，对其转录的蛋白质进行相应的调节，从而抑制肿瘤细胞的凋亡。同时，NF-κB能通过间接途径抑制自身及其他类型的细胞凋亡，并能调控相关基因和蛋白，最终阻止肿瘤细胞凋亡[78]。lnc-GNAT1-1通过对RKIP-NF-κB-Snail的抑制作用发挥抗肿瘤作用，敲除lnc-GNAT1-1基因会上调NF-κB基因的表达，使肿瘤增殖能力增强；同时，lncRNA GAS5可通过减少NF-κB的磷酸化启动NF-κB信号通路[79]。

此外，lncRNAs还可以通过磷脂酰肌醇-3-激酶/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、Notch等信号通路影响肿瘤的增殖、凋亡或转移[62，80]。

3 小 结

随着基因组学的发展，高通量测序技术的出现，高通量生物组学数据库以及高通量高内涵数据统计工具的建立，越来越多的lncRNAs被证实与结肠癌有关。 综上可知，lncRNAs通过调节肿瘤相关的信号通路参与了结直肠癌的发病。故对于结直肠癌相关lncRNAs的研究有利于更清楚地揭示结直肠癌的发病、侵袭和转移原理，从而为结直肠癌的治疗提供重要靶点。且通过药物敏感性lncRNAs 的检测可为患者提供个性化的治疗方案，加速结肠癌精准治疗的步伐。未来，结直肠癌中敏感性很高的lncRNAs有望成为临床结直肠癌早期诊断的指标。