错配修复缺陷与结直肠癌关系的研究进展

孙 田，柳青峰，肖明明，臧 辉，梁 静

(1.中国医科大学研究生院，沈阳 110122； 2.辽宁省人民医院普外科，沈阳 110016；3.辽宁省人民医院病理科，沈阳 110016)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界上第三大常见的恶性肿瘤[1]和第二大癌症死亡原因[2]，也是排名前十的影响全球公共卫生健康的疾病。据统计[3]，目前CRC的全球总病例数约为180.5万，其发病率和死亡率在世界范围内差异较大。在许多中-高人类发展指数的国家(亚洲、南美洲等)，CRC的发病率和死亡率呈升高趋势，相比之下，在最高人类发展指数国家却保持稳定或下降趋势，这种差异与早期筛查和医疗改善的相关性较大。Austin等[4]发现高年龄组(50岁或以上)CRC的发病率下降，但年轻组(50岁以下)上升，差异可能与遗传风险因素富集有关[5]。据我国2015年流行病学的统计数据显示[6]，CRC的发病率和死亡率均排名所有恶性肿瘤的第五位，男、女性的发病率和死亡率也位居前列，CRC新发总例数为37.63万，死亡总例数为19.10万，城市的发病率高于农村。伴随着人口基数大、地域形式多样和文化信仰不同等问题，我国癌症防治措施有待进一步加强。

CRC是一种复杂的异质性疾病，多种因素影响病情的发生、发展和转归。CRC可因遗传和非遗传因素的影响而发病，因遗传因素而引起的CRC可分为家族性腺瘤性息肉病、遗传性非息肉性CRC等类型，由非遗传性因素即仅影响单个细胞及其后代引起的CRC称为散发性CRC[7]。调查显示，高达35%的CRC与遗传因素相关[5]，且年龄是主要的危险因素[8]。人体内存在多种机制维持遗传物质的稳定，其中一种称为DNA错配修复(mismatch repair，MMR)，MMR过程需要多种蛋白质的参与，它们可以在DNA复制后修复错误位点，维持DNA的高度保真性，进而减少基因突变。MMR缺陷(deficient mismatch repair，dMMR)与多种恶性肿瘤存在明显的相关性,如CRC、子宫内膜癌、乳腺癌等，并且MMR在CRC的诊断和治疗过程中也发挥重要作用[9-12]。随着病理分子学和基因学等技术的发展，CRC的诊断和治疗水平有了很大提高，使医师有了更准确的诊治方式，也使患者获得了更好的治疗效果，MMR在CRC中有广阔的应用前景。现就dMMR与CRC的相关研究进展进行综述。

1 dMMR概述

1.1发生发展及产生机制 MMR是一种高度保守的细胞过程[12]，其中涉及多种蛋白质，并在DNA复制过程中起重要作用。DNA的MMR基因最早在原核生物中被发现，作用于细胞内，负责在DNA复制后对碱基进行MMR，另外也可以修复一些小的核苷酸插入或缺失，而后其相关基因也在人类细胞和酵母菌中被发现[13]。MMR的关键基因包括MutL同源物1(Mult homolog 1，MLH1)、MutS同源物2(Mult homolog 2，MSH2)、MSH6和减数分裂后分离增加2(postmeiotic segregation increased 2，PMS2)等。已有研究证实，MMR基因在双链断裂修复，细胞凋亡和重组中发挥作用[14]。MMR基因表达产物称为MMR蛋白，在DNA复制、遗传物质重组和化学或物理损伤过程中以异二聚体复合物的形式存在，进行错配碱基的鉴定及其后续修复[15]。这些复合物包括MutSα(MSH2蛋白与MSH6蛋白组合)、MutLβ(MLH1蛋白与PMS1蛋白组合)、MutSβ(MSH2蛋白与MSH3蛋白组合)和MutLα(MLH1蛋白与PMS2蛋白组合)。在DNA复制发生错配后，首先MutSα识别并结合DNA链，招募MutLα，经构象改变后，从错误位点释放，随后招募核酸外切酶-1切除错配区域，复制因子A稳定单链DNA，由DNA聚合酶Polδ和增殖细胞核抗原形成的复合物填补空缺，最后由DNA连接酶修复缺口[1-2,14]。有研究证实[12]，MMR使DNA复制的准确性提高了100～1 000倍。若MMR基因或蛋白功能缺陷，DNA复制错误得不到修正，错误的逐渐积累加剧基因的变异，进而产生dMMR表型。总之，dMMR可以通过3种主要机制[16]发生：①体细胞MMR基因的高度甲基化，最常见的是MLH1缺陷；②以Lynch综合征为代表的MMR基因的遗传种系突变；③MMR基因中存在的双体细胞突变，并且dMMR肿瘤也会表现一定的组织病理学特征[7]，包括增加的肿瘤浸润淋巴细胞，克罗恩样肿瘤周围淋巴细胞反应，黏液/印戒细胞分化和髓质分化等。dMMR使DNA复制错误积累，增加染色体重排和基因变异，是CRC发生、发展的一种重要机制。

1.2免疫组织化学检测 免疫组织化学检测常用于评估MMR蛋白(包括MLH1，MSH2，MSH6和PMS2蛋白)的表达情况。根据MMR蛋白的表达情况可将其分为两种类型[17]：若一种或多种MMR蛋白表达缺失称为dMMR，无缺失称为正常的MMR(proficient mismatch repair，pMMR)。免疫组织化学检测具有技术简便、操作易行、成本低，且敏感性和特异性与基因检测相仿等优点，如Lu和Sheng[18]研究发现，免疫组织化学检测对MLH1和MSH2突变的灵敏度为79%～95%，但其不能检测出种系突变，查明突变的具体位置，这就需要聚合酶链反应等相关检测进行确认。对其检测的结果来说，实际情况有所不同，因为MMR蛋白具有异二聚体的性质，蛋白质的表达丧失又有可能是其配对蛋白质表达丧失的结果。如单独PMS2或MSH6蛋白丢失可表明其存在缺陷，但当MLH1和PMS2蛋白均表达丧失时，可能仅仅是因为MLH1的丧失使PMS2不稳定而导致的。MSH6和MSH2同样如此。另外，免疫组织化学检测的染色结果也会有异常的情况出现，如染色不完整，或呈灶状，但未完全缺失，染色位于细胞质而非细胞核等，这可能与核定位序列的缺失、实际使用固定剂的差异或组织固定均匀性的不同等因素相关[14]。因此，实际工作中检测结果的评估有待进一步探究。总之，免疫组织化学检测优势明显，符合现状，可用于评估MMR状态，筛选试验或临床分析试验，在临床上已广泛应用。

2 dMMR CRC的临床特征及预后

dMMR是人类发现的一种重要的CRC致病机制，并为研究CRC的发生、发展提供了重要的线索和依据。约15%的CRC与dMMR相关[17,19]。MMR状态不同的CRC在年龄、TN分期和性别等特征上有所不同。如高度微卫星不稳定(microsatellite instability-high,MSI-H)的dMMR CRC患者显示出一定的临床特征[17,20]，包括多见于女性，近端肿瘤位置，分化差的黏液表型等，并且dMMR是Ⅱ期和Ⅲ期CRC患者预后良好的标志物，这些特征与pMMR患者存在明显的差异性，在肿瘤微环境上也是如此，应用dMMR肿瘤微环境的相关特性可为患者的预后提供参考依据。dMMR CRC与非转移性患者较高的中性粒细胞计数、中性粒细胞/淋巴细胞比率和C反应蛋白水平相关，但中性粒细胞/淋巴细胞比率仅在pMMR CRC中具有预后价值[21]。此外，因为dMMR CRC遗传物质稳定性低，可使部分肿瘤基因失活，若失活位点为转移所必需，那么会在一定程度上改善患者的预后。Yan等[17]临床研究表明，在近端结肠癌和直肠癌中，pMMR患者更倾向于晚期并且淋巴结转移，原因可能是dMMR导致重组人转化生长因子-β受体2基因突变失活，使肿瘤细胞不易发生上皮-间充质转化过程，而该过程是转移中的关键事件[21-22]。但有研究得到相反的结论，Goldstein等[23]证实，BRAF V600E突变是MSI-H dMMR转移性CRC的不良预后因素，常见于Ⅳ期CRC患者(41%)，虽然这部分患者存在MSI-H，但生存期不能明显延长，相反，pMMR是延长无进展生存期和总生存期的独立因素[17]。因此，对于转移性和非转移性患者相关结论不能等同替换，需要更多的样本及数据进行研究。

目前，肠道微生物组与MMR CRC之间已建立一定的联系，并且在CRC的诊断、预防和治疗中表现出良好的应用前景。Hale等[24]将肿瘤生物学和微生物生态学结合在一起研究CRC后发现，相比于pMMR CRC，脆弱拟杆菌和硫化原球菌梭状核在dMMR CRC中显著富集，并证实dMMR和pMMR CRC微生物群落的影响网络之间的差异仅与肿瘤或正常相邻的微生物群有关，再次强调了将MMR状态加入CRC微生物组研究的重要性[25-26]，这些发现为今后CRC的研究及诊疗提供了新思路和新手段。

2.1dMMR与Lynch综合征、Lynch样综合征 约3%的CRC患者由MMR基因(MLH1，PMS2，MSH2和MSH6中一种或多种)发生种系突变造成，被称为Lynch综合征相关CRC,又可称为遗传性非息肉性CRC。Lynch综合征是最常见的遗传性CRC易感综合征[5]，属于常染色体显性遗传病，具有较高的外显率，Lynch综合征患者发生CRC的风险高于一般人群，其终生累积发病率高达80%[27]，并且也增加了患其他类型癌症的风险，如子宫内膜癌、卵巢癌和胃癌等。Lynch综合征的存在依据是微卫星不稳定的存在和(或)通过免疫组织化学确定缺乏MMR蛋白的表达，以及在DNA MMR基因中存在有害的种系突变。MLH1或MSH2的突变占所有Lynch综合征相关癌症的60%～80%，其他病例可归因于MSH6或PMS2突变[28]。PMS2突变与Lynch综合征的特殊表型[9]相关，即患者的发病年龄较大，常无相关家族病史，肠镜见结肠息肉较多等。Ligtenberg等[19]研究发现一种特殊类型，即上皮细胞黏附分子基因(紧邻MSH2的上游)删除其终止密码子导致甲基化，而诱导的MSH2基因沉默，形成Lynch综合征，其比例小于5%[5]，而Richman[14]证明，上皮细胞黏附分子种系突变的存在与其表达缺失之间存在高度特异性，并建议在MSH2阴性肿瘤患者中加入相关检测。总之，这些差异凸显了MMR不同基因之间的可变外显率以及基因癌症风险评估的重要性。目前，Lynch综合征相关CRC的诊断标准依据的是阿姆斯特丹Ⅱ标准和修订的Bethesda标准[22]。早期筛查CRC患者是否因Lynch综合征引起已为医疗人员所认可，而Lynch综合征的通用肿瘤筛查也是在CRC上进行的，用以早期确定原因不明的MLH1甲基化和种系突变的dMMR患者[10]，但对于Lynch综合征的携带者，因没有特征性的临床表型，尤其是没有癌症家族史的患者，目前没有较好的筛查方法[29]。因此，对于Lynch综合征患者家属更需要遗传物质鉴定和筛查，以达到早期预防和治疗的目的。

特别需要说明的是，有关临床研究也发现，没有MMR基因(包括MLH1，PMS2，MSH2和MSH6)种系突变的dMMR约占Lynch综合征总数的70%[8]，并应用Lynch样综合征来提及不明原因的肿瘤dMMR现象[10]。在发病机制上，多数Lynch样综合征患者出现MMR基因的双等位基因失活[30]，其突变率相对较低，并且可以在一定程度上解释，与Lynch综合征患者相比，Lynch样综合征患者的一级亲属患CRC和其他癌症的风险较低[31]。在临床病理特征上，Lynch综合征和Lynch样综合征的CRC患者的平均发病年龄接近(48.5岁比53.7岁),重要的区别特征在于CRC较低的标准化发病率(6.04%比2.12%)[32]，临床研究发现前者更容易发生于左半结肠和直肠，后者更易发生于右半结肠[10]。目前对于Lynch样综合征和Lynch综合征患者，未解答的关键问题是遗传特性的风险评估和管理的不确定性，在无癌个体中识别相关患者以及如何利用其独特的免疫生物学特性进一步治疗是今后的研究中面临巨大的挑战。

2.2dMMR与散发性CRC 大多数dMMR CRC由MLH1基因启动子区的异常甲基化引起[11]，即引起散发性CRC。在免疫组织化学证实MLH1缺失的患者中，约75%为散发性，且散发性MSI-H CRC占所有CRC的3%～15%[20]。反过来，MLH1启动子的高甲基化在散发性CRC的发生发展中起重要作用，这种机制造成了MLH1基因蛋白的表观遗传损失，与体细胞的BRAF基因的密码子600(V600E)突变有关[27]，也有学者将其称为高CpG岛甲基化表型，并可导致抑癌基因失活。CpG岛甲基化表型的肿瘤也具有一定的临床特征[25]，如通常位于近端结肠，具有BRAF基因突变，并且由无柄锯齿状腺瘤引起。但在一小部分MSI-H CRC中也观察到MLH1甲基化和CpG岛甲基化表型状态之间的不一致性[20]，这些差异表现出散发性CRC发病机制的复杂性，且临床病理特征的研究结果也不同,散发性CRC的致病机制复杂，表型多样，其与dMMR的相关研究有望为dMMR CRC的诊断和治疗提供更有意义的依据。

3 dMMR 与CRC的治疗

3.1化疗 对于CRC目前主张多学科的综合治疗，其中基于氟尿嘧啶的辅助化疗已被证实能够减少复发及延长生存期，特别是Ⅲ期患者[33]。目前更多的研究认为，与低度微卫星不稳定和微卫星稳定CRC患者相比，MSI-H CRC患者辅助化疗的有益效果更少或没有效果[26]。André等[33]在奥沙利铂/5-氟尿嘧啶/亚叶酸钙的结肠癌辅助治疗的多中心国际研究(MOSAIC)中发现，对Ⅱ期或Ⅲ期CRC患者，在5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸方案中添加奥沙利铂可显著改善5年无病生存期和6年总体生存率，且更应在Ⅲ期患者手术后给予[14]。然而，Alex等[34]研究762例转移性CRC患者后证实，dMMR表型对奥沙利铂化疗具有耐药性，且这种性质在散发性dMMR表型中更为明显。同样，Ostwal等[35]在包含419例的局部中晚期直肠癌患者的治疗研究中发现，296例具有dMMR的患者，以基于5-氟尿嘧啶，同时添加奥沙利铂的化疗作为新辅助治疗手段相对缺乏益处。重要的是，该研究可能排除了在晚期直肠癌患者中使用抗dMMR疗法，而这反过来可指导抗pMMR疗法的研发。总之，对CRC辅助治疗，dMMR对未转移患者治疗效果的预测具有一定的价值。目前不能仅凭MMR状态来评估个体辅助治疗效果，基因变异等特殊因素也应考虑在内，这就需要通过多中心、大样本的临床随机对照试验为个体化的综合治疗策略提供依据。

3.2免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)治疗 ICIs治疗已成为抗癌研究的热点,研究者已经在肾细胞癌、肺癌、膀胱癌中证明了其有效性。dMMR会导致动态的超突变状态，从而导致肿瘤细胞新生抗原的持续产生，使其受到免疫监视[36]。然而，肿瘤细胞为了逃避免疫反应，在其细胞表面表达抑制性程序性细胞死亡配体1，其与 T淋巴细胞上的程序性细胞死亡受体1结合并抑制细胞毒活性。研究发现，与pMMR相比，dMMR的CRC具有较高的突变量，并对ICIs治疗具有更高的反应效率[37]。如ICIs单药治疗的反应率在dMMR CRC中为30%～50%[38]。美国食品药品管理局2017年5月23日加速批准pembrolizumab用以治疗成人和儿童无法切除或转移的dMMR实体肿瘤患者，但未能说明免疫治疗的最佳治疗顺序、最佳的治疗持续时间，以及在pembrolizumab中是否可以添加其他药物等问题[39]。因此，可将其看作ICIs探索性治疗的突破进展，Wang等[40]提供了1例73岁患有dMMR的转移性CRC及急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病的女性在长期使用pembrolizumab后症状完全缓解的病例，这在一定程度上激励了免疫治疗的探索。更重要的是，ICIs有望与多种其他药剂联合应用，包括细胞毒性化学疗法、小分子抑制剂、针对促分裂原活化的蛋白激酶途径的靶向药剂和放疗技术等，但仅对少数具有特异突变表型的CRC患者适用，针对这些药物的新型标志物仍有待进一步研究[37]。在转移性高dMMR CRC的一线治疗和切除的Ⅲ期结肠癌的辅助治疗中，使用ICIs的随机临床试验(分别为NCT02563002和NCT02912559)正在进行中[10]。

4 展 望

目前，MMR相关的CRC仍是临床研究的重点，并且微生物或生态学领域研究的进展为研究人员提供了新的研究思路和方式。虽然MMR对CRC的诊断、治疗和预后具有重要指导意义，但仍有许多问题需要解决，如早期发现dMMR问题相关患者，进行家族特异性的风险评估和管理仍具有挑战性；MMR相关疾病的一级预防；对于不明原因的dMMR患者，遗传物质鉴定、遗传咨询和筛选需要更准确及合理的治疗指南；如何利用MMR独特的免疫生物学行为，为患者治疗个体化的治疗方案有待进一步探寻；随着肿瘤医疗研究的发展，癌症患者的整体治疗、联合治疗及其疗效评估亟待大样本多中心试验。