基因检测在肿瘤免疫检查点抑制剂应用中的研究进展

许成，刘朝奇，黄艳芳，白敦耀，罗洁丽

(1.武汉科技大学附属武汉市普仁医院药学部，武汉 430081；2.三峡大学医学院，宜昌 443002 )

免疫检查点抑制剂(immune checkpoint blockade，ICB)旨在通过抑制肿瘤微环境中免疫检查点的负性调节作用，重新激活T细胞，恢复机体抗肿瘤免疫反应，从而达到识别和清除肿瘤的目的[1-2]。其独特的临床疗效，使得癌症治疗的适应证不断扩大，为肿瘤免疫治疗开启了新篇章。近年来，以细胞毒T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4) 和程序性死亡因子(programmed cell death protein-1，PD-1)及其配体(PD-ligand 1，PD-L1)为靶点的ICB在晚期癌症患者中的临床疗效获得肯定，美国食品药品管理局(FDA)先后批准了6种相关单克隆抗体，包括CTLA-4抑制剂ipilimumab(Yervoy)；PD-1抑制剂nivolumab(Opdivo)和pembrolizumab(Keytruda)；PD-L1抑制剂atezolizumab(Tecentriq)、durvalumab(Imfinzi)和avelumab(Bavencio)，分别用于晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱上皮癌等恶性肿瘤的临床治疗。还有以LAG-3、TIM-3、VISTA等免疫检查点为靶点的抑制剂在研究中[3]。目前，这种免疫治疗尚不精准，只有少数癌症患者能够获得良好的疗效[4]。基因检测技术的飞速发展以及肿瘤基因组学认识的不断深入，将使得基因组学驱动的精准肿瘤免疫治疗成为可能。通过对肿瘤进行基因检测，为患者选择合适的给药方案提供遗传学依据，能够使免疫治疗更加精准有效。笔者将以临床疗效确切的CTLA-4、PD-1/PD-L1抑制剂为例，探讨基因检测对肿瘤ICB治疗的重要意义以及其应用。

1 基因检测对ICB治疗的意义

基于免疫组织化学法检测肿瘤组织中PD-L1蛋白的表达，是最早被应用于筛选合适患者的方法。迄今为止的临床数据显示，PD-L1的表达与癌症患者对于ICB的高应答率和无进展生存率有关，但PD-L1表达阴性的患者也可能获得很好疗效[5]。CARBOGNIN等[6]基于Ⅰ～Ⅲ期临床试验中nivolumab、pembrolizumab或atezolizumab对癌症患者的治疗结果，系统地分析了肿瘤细胞PD-L1表达与患者疗效的相关性，结果显示PD-L1表达阳性的肿瘤对抑制剂有更高的应答率，但仍有19.9%(154/773例)PD-L1表达阴性癌症患者表现出客观的反应。因此需要肿瘤微环境免疫调节的更多信息指导合理用药。

肿瘤细胞是由体细胞突变积累产生的，包括碱基替换、碱基插入和缺失、DNA断裂和异常重组引起的重排以及DNA片段拷贝数的变化等[7]。在过去的十年中，基因检测技术，尤其是下一代基因测序(next-generation sequencing，NGS)的革命性进步，以及分析工具的智能化，使得研究人员能够更准确地描述癌症的分类，预测癌症患者的预后，选择有效的癌症治疗方法和个性化的癌症治疗，尤其是癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)计划的完成及“泛癌症图谱(pan-cancer atlas)”计划的推进，使NGS在肿瘤诊断和治疗方面的应用更为重要。NGS包括全基因组测序、全转录组测序、全外显子测序和靶向测序等。NGS技术克服了Sanger测序局限性，它允许在一次试验中对整个基因组进行系统分析，有助于识别肿瘤的分子特征，以及获取肿瘤细胞的全基因组数据[8]。对这些数据的挖掘和分析将为临床医生提供有用的诊断和预后信息，成为肿瘤精准治疗的有力手段。

2 基因检测与ICB的治疗

2.1免疫检查点基因检测 T细胞活化受CTLA-4、PD-1/PD-L1等负性信号通路调节，CTLA-4、PD-1、PD-L1基因的单核苷酸多态性与自身免疫性疾病以及癌症的治疗和预后密切相关[9-11]。药物基因组学的研究发现药物的疗效与药物靶点基因多态性的关系密切[12]。因此ICB的作用靶点CTLA-4、PD-1、PD-L1的基因多态性可能是ICB疗效差异的遗传因素。在黑色素瘤患者中，BREUNIS等[13]已经评估了7个CTLA-4单核苷酸多态性(rs 733618，rs 4553808，rs 11571317，rs 5742909，rs 231775，rs 3087243和rs 7565213)与ipilimumab反应，与临床反应显著相关的基因型为CTLA-4 rs4553808的G等位基因、rs11571327的T等位基因、rs231775的A等位基因位。在50例接受了nivolumab治疗晚期非小细胞肺癌患者中，NOMIZO等[14]检测了患者血浆中PD-L1基因单核苷酸多态性，分析发现PD-L1 rs4143815为C/C或C/G基因型的患者和rs2282055为G/G或G/T基因型的患者有较高的无进展生存率，而PD-L1 rs4143815为G/G基因型的患者和rs2282055为T/T基因型的患者均无治疗效果，提示PD-L1 rs2282055和rs4143815的基因多态性与非小细胞肺癌患者的疗效差异相关。因此通过单核苷酸多态性分析可以预测肿瘤患者对ICB治疗的反应性，指导临床医生的药物选择和治疗方案设计。

2.2肿瘤细胞的微卫星分析 微卫星是自身DNA中的一段简单重复的核苷酸序列。DNA错配修复(mismatch repair，MMR)功能异常造成微卫星序列发生的错误，称为“微卫星不稳定性”(microsatellite instability，MSI)。MSI状态可通过PCR或NGS技术检测。肿瘤中DNA错配修复缺陷(mismatch repair deficiency，dMMR)导致高频率微卫星不稳定(microsatellite instability-high，MSI-H)表型。MSI-H会引起肿瘤细胞突变的积累，导致肿瘤的高突变负荷、新的肿瘤抗原表达、肿瘤浸润淋巴细胞增加以及上调免疫检查点蛋白表达水平，从而影响ICB治疗效应[15-16]。近期的临床试验数据表明，具有MSI-H表型的肿瘤使用PD-1抑制剂治疗的有效率高于其他类型的肿瘤。LE等[16]在一项评估PD-1抑制剂pembrolizumab疗效的Ⅱ期临床试验中，将41例患者分为3组：11例dMMR结直肠癌，21例DNA错配修复正常的结直肠癌，9例非结直肠癌的dMMR癌症患者包括胆管癌、胃癌等，结果显示dMMR结直肠癌患者和非结直肠癌患者客观反应率分别为40%和71%，而DNA错配修复正常肿瘤患者没有出现反应，说明dMMR/MSI-H与pembrolizumab效果之间存在直接的相关性。nivolumab的Ⅱ期临床试验数据也显示nivolumab对dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者有持久的疗效和疾病控制，在74例转移性结直肠癌患者中，23例(31.1%)取得研究人员评估的客观反应，51例(69%)患者在12周或更长时间里出现疾病控制[17]。基于前期的临床研究结果，FDA在2017年5月加速批准了PD-1抑制剂pembrolizumab(Keytruda)用于治疗表型为MSI-H或dMMR的实体肿瘤；2017年7月加速批准了PD-1抑制剂nivolumab(Opdivo)用于治疗具有MSI-H或dMMR表型的转移性结直肠癌患者[18-19]。因此通过微卫星分析筛选的MSI-H表型肿瘤更能获益于ICB的治疗。

2.3肿瘤突变负荷检测 肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)即肿瘤基因组中每兆碱基中突变的数目。使用全外显子测序技术(whole exome sequencing，WES)能够检测肿瘤样本中所有的体细胞突变[9]。高TMB的肿瘤具有产生更多肿瘤新抗原的潜力，从而激活免疫系统对肿瘤的识别和清除，提示高TMB能增强肿瘤对ICB治疗的敏感性[20]。临床试验发现ICB对于黑色细胞瘤和非小细胞肺癌等带来了显著疗效，而对于胰腺癌、前列腺癌疗效甚微。进一步分析这些癌症的突变负荷，发现对ICB治疗有较高应答率的肿瘤具有高突变负荷，包括黑色素细胞瘤和非小细胞肺癌；相反，胰腺癌和前列腺癌等具有较低的突变负荷，提示TMB与ICB治疗的应答率相关[21-22]。SNYDER等[23]应用WES技术分析了64例接受CTLA-4抗体治疗患者的恶性黑色素瘤外显子基因，提示高突变负荷与持续的临床反应相关。RIZVI等[24]使用WES技术对患者进行了非小细胞肺癌的外显子序列分析，同样发现具有较高突变负荷的非小细胞肺癌患者接受PD-1抗体的治疗有较高的客观反应率和无进展生成率。另外，吸烟肺癌患者的突变负荷远高于不吸烟肺癌患者[25]。因此，在PD-1抗体治疗非小细胞肺癌患者中，观察到吸烟患者的应答率更高[5]。2017年，FDA批准了基于NGS的癌症体外诊断产品Foundation One CDx(F1CDx)，用于对肿瘤324个基因的遗传变异以及基因组MSI、TMB的检测分析，进一步肯定了MSI、TMB的应用价值。因此TMB对于ICB疗效具有潜在的预测意义。

2.4肿瘤特异性抗原检测 肿瘤特异性抗原(tumor specific antigens，TSAs)是由癌细胞的基因突变产生的，在正常细胞中不表达。由于这类抗原对肿瘤细胞具有高度的特异性，可使免疫细胞能够区分癌变细胞和正常细胞，从而避免自身免疫风险，是肿瘤免疫治疗的潜在靶点，近年来引起了广泛的关注。有研究表明，TSA是ICB发挥治疗效应的关键因素之一。VAN ALLEN等[26]对110例转移性黑色素瘤患者进行了全外显子测序，发现有大量新抗原的转移性黑色素瘤肿瘤患者更有可能对CTLA-4抑制剂治疗产生应答。GUBIN等[27]在小鼠MCA肉瘤模型中展示了接受PD-1或/和CTLA-4抑制剂治疗的小鼠能介导TSA激活T细胞并导致肿瘤排斥反应。现在NGS技术能以前所未有的精确度和速度揭示单个肿瘤(突变体)的突变谱，但从非同义突变中筛选出肿瘤特异性突变依赖于专业的分析技术，因此，检测肿瘤特异性抗原在临床上的应用仍受到限制。

2.5人类白细胞抗原检测 肿瘤抗原通过加工被呈递到细胞表面才能被T细胞识别，这是ICB治疗的前提基础。肿瘤抗原需要与人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)相结合后才能提呈到细胞表面[1]，因此HLA在某些肿瘤表达下调或丢失，直接影响ICB的疗效。INOUE等[28]对比了13例转移性黑色素瘤患者接受nivolumab治疗前后的免疫相关基因mRNA表达水平，发现在治疗前，应答者的HLA-Ⅰ类的HLA-A基因mRNA表达水平显著高于非应答者，说明HLA-A基因的高表达水平与nivolumab较好的临床疗效相关。CHOWELL等[29]通过对1500多例接受过ICB治疗的癌症患者的HLA-Ⅰ类基因型分析，发现HLA-Ⅰ基因杂合性越高的癌症患者越有可能从ICB的治疗中获益。此外，有研究表明HLA-Ⅰ类抗原表达与ICB的耐药性有密切关系。ZARETSKY等[30]应用全外显子测序分析了4例转移性黑色素瘤患者的活检标本，发现对PD-1抗体的获得性耐药可通过JAK 1/2突变失活下调IFNγ信号通路；或通过B2M基因突变介导HLA-Ⅰ类抗原表达的缺失。GETTINGER[31]等在对ICB耐药的肺癌患者以及B2M基因敲除的肺癌小鼠模型中观察到B2M的获得性纯合子丢失，使得HLA-Ⅰ类表达缺乏，导致对ICB抵抗。因此应用基因检测技术分析HLA的表达情况，可用于指导ICB治疗。

3 结束语

基因检测技术的发展以及其在临床应用的拓展为ICB的精准治疗带来新的思路。针对每个肿瘤基因组进行的基因检测分析，掌握影响ICB疗效的相关基因信息，可为每个患者提供个性化的用药策略。一些ICB治疗的相关基因变化，包括免疫检查点基因多态性、微卫星不稳定状态、肿瘤突变负荷等在临床试验中已被证明对ICB临床疗效有一定的预测价值，但这些标志物的适用范围、协同关系和应用标准还有待进一步明确。NGS已在大规模的肿瘤基因检测中展现了巨大应用前景，在临床试验中通过对晚期癌症患者进行基因组检测，为患者提供合理的治疗方案，但目前NGS的临床推广应用还存在若干问题，如成本效益、周转时间和临床结果解释等。相信在未来的肿瘤治疗中，随着基因检测技术在临床应用中的进一步推广，尤其是“泛癌症图谱”的研究进展，及其对各类肿瘤相关基因的挖掘，使得基于基因检测实时监控抗肿瘤免疫的应用成为可能，将能更好指导ICB药物的个体化精准治疗。