秸秆还田和腐熟有机肥对植烟土壤养分、酶活性及微生物多样性的影响

樊 俊，谭 军*，王 瑞，赵秀云，李 伟

1.湖北省烟草公司恩施州公司技术中心，湖北省恩施市市府路65号 445000

2.华中农业大学生命科学技术学院，武汉市洪山区狮子山街1号 430070

秸秆中含有农作物生长需要的多种营养元素，可作为农业生产中重要的肥料资源。但我国秸秆利用指数不高，秸秆还田率不足50%，且大部分被焚烧，对环境造成了严重污染［1］。秸秆还田作为一种直接有效的利用方式，不但解决废弃秸秆的环境污染问题，也可以促进农村养分资源的循环利用和农业可持续发展［2］。腐熟有机肥培肥土壤在中国有着悠久的历史，是改良土壤结构、提高土壤肥力和增加作物产量的有效措施［3］。有机物料施入土壤能有效提高有机质含量，在综合改善土壤水、肥、气、热等方面具有较好生态效益［3-4］。土壤微生物和酶在土壤生态系统的有机质分解和养分循环中起到重要作用，也是土壤环境质量变化的敏感因子［5-6］，被认为是评价土壤质量最重要的两个生物学指标［7-8］。因此，开展秸秆还田和施用腐熟有机肥对土壤养分、酶活性和微生物多样性的影响研究，能有效揭示有机物料施入后的土壤质量变化，对完善土壤改良技术具有重要意义。

虽然有关秸秆还田及施用腐熟有机物培肥土壤方面的文献报道较多［9-12］，但秸秆直接还田和施用腐熟有机肥对土壤养分提升和功能性微生物改善效应，以及采用秸秆直接还田能否替代腐熟有机物改良土壤方面目前还没有确切的定论。为此，进行了水稻秸秆、玉米秸秆、烟草秸秆和腐熟有机肥还田的田间定点小区试验，探讨秸秆还田和腐熟有机肥对植烟土壤养分含量、酶活性、微生物数量及功能性微生物相对丰度的影响，旨在为提高当地土壤生产力和优质烟叶生产水平提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地点设置在湖北省宣恩县椒园镇凉风村（29°9772'N，109°3943'E）。海拔813 m，属亚热带季风湿润型山地气候。年均气温13.7℃，无霜期263 d，年降水量1 635.3 mm，年日照时数1 212.4 h。试验田为长年种植烟草的旱地，地势平坦。供试土壤类型为黄棕壤，试验前耕层土壤（0～20 cm）pH 5.37，有机质18.5 g/kg，碱解氮105.2 mg/kg，速效钾223.3 mg/kg，有效磷18.3 mg/kg。

1.2 试验设计

设置3年的定位秸秆还田试验，时间为2015年2月—2017年9月。5个处理分别为：（1）水稻秸秆15 000 kg/hm2（RS）；（2）玉米秸秆15 000 kg/hm2（MS）；（3）烟草秸秆 15 000 kg/hm2（TS）；（4）腐熟烟秆有机肥 15 000 kg/hm2（TOF）；（5）对照，不翻压秸秆（CK）。其中秸秆均为干质量，用粉碎机粉碎至长度5～10 cm。在烟株移栽前的整地过程中，将各处理的秸秆或有机肥均匀撒入各小区，采用旋耕机翻入0～20 cm深的耕层土壤中，再掏沟、施肥、起垄、覆膜、移栽烟株。每处理重复3次，小区面积为40 m2，种烟60株，随机排列。试验田N∶P2O5∶K2O为1∶1.75∶3.05，各试验小区化肥施用量一致，为3.6 kg烟草专用复合肥（8∶12∶24），1.5 kg过磷酸钙（0∶12∶0），0.45 kg硝酸钾（13.5∶0∶44.5）。

1.3 测定项目与方法

在连续还田处理第3年的烟叶采收完成后，每试验小区按“S”取样法分别取0～20 cm垄体耕层土壤充分混匀，带回室内剔除植物残体和其他杂物，一部分进行土壤理化指标［13］和酶活性［14］测定；另一部分保存于-80℃冰箱中，利用土壤DNA抽提试剂盒 Fast DNA®SPIN Kit for Soil（美国Qbiogene公司）提取土样的总DNA，借助于16S rDNA和18S rDNA的通用引物对提取的土壤总DNA进行PCR扩增，通过高通量测序技术对扩增序列进行测序比对［15］，使用USEARCH方法，对各样品的Effective Tags进行聚类，将序列相似性达到97%的序列聚类生成操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTUs）［16］。在烟叶移栽 60 d 后，按照标准方法［17］进行青枯病发病率调查，并计算病情指数。

1.4 数据处理

试验数据用DPS 7.05和EXCEL 2003进行统计分析。min-max标准化数据处理是对原始数据的线性变换，使结果值映射到［0，1］。

式中：x为标准化归一后的值，X1为对应的样本数据值，Xmax为样本数据的最大值，Xmin为样本数据的最小值。

Shannon指数（H）是广泛使用的物种多样性指数之一，其值高则群落中各物种具有越大的均匀度，群落物种多样性越高［18］。Chao1指数是对各样品OTUs数目进行计算，所计算Chao1结果值越大，表明微生物群落的丰富度越高［18］。

Shannon指数计算公式：

式中：ni为第i个微生物种类的个体数目，N为群落中所有微生物种类的个体总数。

2 结果与分析

2.1 秸秆还田和腐熟有机肥对土壤养分的影响

表1表明，玉米秸秆、水稻秸秆和烟草秸秆还田处理的土壤碱解氮、速效磷、阳离子交换量（CEC）较对照差异不明显；土壤速效钾含量为398.2～438.1 mg/kg、有机碳含量为11.33～12.31 g/kg、有效锌含量为2.02～2.24 mg/kg、有效镁含量为82.6～88.2 mg/kg、有效硼含量为0.343～0.400 mg/kg，分别较对照提高29.4%～42.4%、12.1%～19.4%、2.5%～13.7%、21.8%～30.1%和0～16.6%。有机肥还田处理的土壤速效磷、速效钾、有效锌、有效镁、有效硼含量显著高于其他秸秆直接还田处理和对照，表明秸秆腐熟还田对提高土壤养分的效果较直接还田更显著。

表1 秸秆还田和腐熟有机肥对土壤养分的影响①Tab.1 Effects of straw returning and decomposed organic manure on soil nutrient contents

2.2 秸秆还田和腐熟有机肥对土壤酶活性的影响

土壤酶活性反映了土壤中各种生物化学过程的强度和方向［19］，有机肥物料的施入对土壤酶活性有重要影响（表2）。秸秆还田和腐熟有机肥处理后，土壤蔗糖酶和酸性磷酸酶的活性明显增加，分别较对照处理提高了25.0%～129.5%和2.9%～25.1%；土壤脲酶活性有增加的趋势，以水稻秸秆还田处理表现最好，较对照提高55.0%。水稻秸秆、玉米秸秆和烟草秸秆还田处理的土壤过氧化氢酶较对照降低4.9%～13.1%，有机肥还田处理对其影响不明显。说明秸秆还田处理对不同种类酶活性的影响不同，对土壤蔗糖酶、酸性磷酸酶活性和脲酶活性有提高的趋势，对过氧化氢酶活性有降低趋势。通过对4种酶活性的min-max标准化加权值比较，有机肥还田处理对土壤酶活性影响综合表现最好，其次为烟草秸秆和水稻秸秆还田处理，玉米秸秆还田处理的效果较差。

表2 秸秆还田和腐熟有机肥对土壤酶活性的影响Tab.2 Effects of straw returning and decomposed organic manure on soil enzyme activities

2.3 秸秆还田和腐熟有机肥对土壤微生物多样性的影响

根据细菌16S rDNA和真菌18S rDNA鉴定出的种类数（OTUs）统计结果（表3）可知，烟草秸秆还田的土壤真菌OTUs值最高，较对照提高55.6%，其次为玉米秸秆和有机肥还田处理；腐熟有机肥处理的土壤细菌OTUs值最高，较对照提高13.2%，其次为水稻秸秆还田处理。不同秸秆还田处理的土壤真菌Shannon指数在4.61～4.92之间，土壤细菌Shannon指数在9.95～10.61之间，各处理间差异较小，以腐熟有机肥处理效果较好。烟草秸秆还田的土壤真菌Chao1指数最高，较对照增加20.8%，其次为玉米秸秆和有机肥还田处理；土壤细菌Chao1指数最大的为玉米秸秆还田处理，较对照增加10.0%，其次为腐熟有机肥处理。综合分析，秸秆还田土壤微生物OTUs总数量较对照提高7.4%～15.5%，说明秸秆还田对提高土壤微生物数量效果明显，最好的为腐熟有机肥处理，其次为玉米秸秆和水稻秸秆还田处理；秸秆还田对土壤微生物群落多样性的影响效果不明显，但对提高微生物群落的丰富度有明显效果，以玉米秸秆和腐熟有机肥还田处理的效果较好。

表3 秸秆还田和腐熟有机肥对土壤微生物多样性的影响Tab.3 Effects of straw returning and decomposed organic manure on soil microbial diversity

2.4 秸秆还田和腐熟有机肥对土壤功能性菌属的影响

秸秆还田可降低植烟土壤硝化功能菌属和反硝化细菌的相对丰度，降低幅度分别为10.1%～38.3%、26.5%～56.6%；但增加了土壤固氮菌属微生物相对丰度，尤其是根瘤菌属（Rhizobium）、短根瘤菌属（Bradyrhizobium）和中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium），固氮菌整体增加幅度为18.3%～52.0%，说明秸秆直接还田可降低土壤微生物硝化反应速率、反硝化反应速率和增加土壤固氮菌微生物相对丰度，这可能更有利于土壤微生物固氮；而腐熟有机肥还田土壤固氮菌相对丰度降低，幅度达16.4%，这可能不利于土壤微生物氮的固定。秸秆还田植烟土壤烟草致病菌的相对丰度有降低的趋势，尤其是玉米秸秆和烟草秸秆，但差异较小；腐熟有机肥处理土壤烟草致病菌的相对丰度较对照降低37.9%，表明秸秆腐熟后还田对降低烟草感病风险的效果优于秸秆直接还田，见表4。

表4 秸秆还田和腐熟有机肥对特征菌属相对丰度的影响Tab.4 Effects of straw returning and decomposed organic manure on relative abundance of functional bacteria （%）

2.5 秸秆还田和腐熟有机肥对烟草青枯病发病率和病情指数的影响

图1表明，移栽60 d后烟株青枯病发病率和病情指数以腐熟有机肥处理最低，分别为11.81%和1.77，较对照降低73.8%和86.7%，明显低于秸秆还田和对照；其次为秸秆还田处理，分别较对照处理降低46.1%～58.5%、65.9%～71.7%，效果达到显著水平。表明连续3年施用有机物料能有效降低烟草青枯病发病率和病情指数，而腐熟有机肥的防治效果优于秸秆直接还田。

图1 秸秆还田和腐熟有机肥对青枯病发病率和病情指数的影响Fig.1 Effects of straw returning and decomposed organic manure on incidence rate and disease index of tobacco bacterial wilt

3 讨论

3.1 秸秆还田和腐熟有机肥对植烟土壤养分和酶活性的影响

土壤含量低的中微量元素通过施肥补充少，易出现亏损，导致作物生长不良，严重的甚至造成大幅度减产［20］。作物秸秆中含有大量的氮、磷、钾及中微量营养元素，秸秆还田可以作为土壤养分元素缺乏的重要补充途径。本试验中秸秆还田和腐熟有机肥处理的土壤中速效氮、钾、镁、硼等养分含量均有增加，说明有机物料施入土壤可以在一定程度上弥补由于作物收获而导致的农田矿质元素缺失，维持土壤养分的良性循环。同时，腐熟有机肥还田的肥效较秸秆还田更高，其原因一方面是烟秆经过发酵处理，养分释放更加迅速和充分；另一方面可能是烟秆在腐熟发酵过程中，添加了一定量的高养分物质以利于其更好发酵［21］，造成了腐熟烟秆有机肥养分含量较秸秆原料更高。

土壤酶活性受土壤微环境的影响，能有效反映土壤的质量和健康状况［12,19,22］，轻微的环境改变会使土壤中酶活性发生变化。本试验中秸秆还田和腐熟有机肥处理，土壤蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性与对照相比显著增加，与前人的研究结果相似［23］，其原因可能是有机物料还田为微生物代谢提供更多可供分解的植物残体［24］，进而促进了土壤酶的产生；另一方面，有机肥物料本身也带入大量活的微生物，而土壤酶主要来自微生物和植物根系的分泌作用。另外，有机物料的加入导致土壤过氧化氢酶活性降低，与路怡青等［25］的研究结果不一致，具体原因还有待进一步研究。

3.2 秸秆还田和腐熟有机肥对植烟土壤微生物的影响

秸秆还田能有效提高土壤微生物物种丰富度和群落多样性，有利于土壤养分循环及肥力的提升，形成良好的土壤生态体系［26］。本研究表明，秸秆还田和腐熟有机肥对提高土壤微生物数量有明显作用，对增加植烟土壤微生物群落丰富度也有一定效果，与前人的研究结果一致［27］。同时，秸秆直接还田能够不同程度促进或抑制土壤微生物种类数量变化，引起土壤功能性微生物菌群的改变，增加了土壤固定菌群相对丰度，可能更有利于土壤微生物对氮的固定；而腐熟有机肥降低了土壤固氮菌相对丰度，相对于秸秆直接还田，有机肥还田对土壤物理性状、耕层土壤通透性的改善效果稍差［28］，不利于好氧性固氮微生物的生长繁殖。

假单胞菌属（Pseudomonas）、伯克霍尔德菌（Burkholderia）、劳尔氏菌属（Ralstonia）和芽胞杆菌属（Bacillus）等致病性细菌与烟草的野火病、细菌角斑病、黑斑病、青枯病和剑叶病等的发生密切相关［29］。烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的土传病害，其发生不仅与高温高湿的气候有关，还与土壤种类、土壤养分、连作情况、移栽时期、中期管理等有关［30］。本研究表明秸秆直接还田对青枯病发病率和病情指数的抑制效果好于对照，可能是由于秸秆还田通过改善土壤物理结构和提高土壤养分水平使青枯病的发病率降低［31］。腐熟有机肥还田对土壤微生物的繁殖和群落结构的改善效果最好［32-33］，对降低烟草感病风险的效果好于秸秆还田，与试验田青枯病发病率和病情指数规律基本一致，说明腐熟有机肥还田有利于降低烟草病害的发生率。其原因一方面是因为施用有机肥料等措施能有效保持土壤养分平衡，增加土壤微生物多样性，促进有益微生物通过与病原菌竞争营养物质来减缓病原菌的繁殖速度［34］；另一方面腐熟有机肥还田能增加有益微生物的丰度如链霉菌（Streptomyces spp.）等［35］，有益微生物可通过产生多种活性物质如抗生素等来抑制病原菌的繁殖，进而抑制有害微生物的生长从而达到防病的效果。

4 结论

秸秆还田和腐熟有机肥处理可有效增加植烟土壤养分含量，显著提高土壤蔗糖酶活性、酸性磷酸酶活性和脲酶活性。以腐熟有机肥效果最好，其次为烟草秸秆和水稻秸秆处理。秸秆还田和腐熟有机肥处理可提高植烟土壤微生物OTUs数量和群落的丰富度，对微生物多样性影响不明显。秸秆直接还田增加了土壤固定菌群相对丰度，降低了硝化功能菌和反硝化功能菌的相对丰度，有增加土壤微生物固氮能力的趋势；施用腐熟有机肥降低了固氮菌相对丰度，对致病菌的抑制效果优于秸秆直接还田，更有利于降低烟草病害的发生率。