RNA 干扰成纤维细胞生长因子受体3 基因对卵巢癌细胞增殖凋亡、免疫及NF-κB 信号通路的影响

2019-02-23郑广韩婷婷杨钰

实用医学杂志 2019年2期

郑广韩婷婷杨钰

1齐齐哈尔医学院附属第三医院肿瘤一科（黑龙江齐齐哈尔161002）；2齐齐哈尔第二医院妇产科（黑龙江齐齐哈尔161002）

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病隐匿，发展迅速，大多数患者诊断时已发生转移及扩散，尽管采取手术和化疗，但患者5年的生存率很低［1］。成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）定位于人类4p16.3，为跨膜酪氨酸激酶受体糖蛋白，近些年的研究显示，在多种肿瘤中FGFR3 出现过度表达，其高表达影响肿瘤的发生发展［2］。目前FGFR3 在卵巢癌中的研究较少，有研究显示，卵巢癌中FGFR3表达上调，通过siRNA 敲减卵巢癌FGFR3 的表达后可抑制癌细胞的增殖［3］。这提示抑制FGFR3 表达可能影响卵巢癌的发生发展。关于FGFR3 对卵巢癌细胞凋亡及机制研究的尚未明确。RNA 干扰技术是一种能特异性的沉默基因表达的技术，作为一种抗癌的方法在研究各种肿瘤中被广泛的应用［4］。本研究通过RNA 干扰技术沉默卵巢癌SKOV-3 细胞FGFR3 表达，将干扰FGFR3 表达的siRNA 转染SK-OV-3 细胞，检测细胞的活力、凋亡率及免疫逃逸相关基因B7-H1 表达，并进一步研究可能的分子机制，为卵巢癌的诊疗提供理论帮助。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂和仪器人卵巢癌SK-OV-3细胞株购自上海细胞所；RPMI1640 培养基、双抗、胎牛血清及胰蛋白酶均购自美国Gibco；FGFR3、B7-H1、p-NF-κB、p-IκB、cyclinD1、survivin 抗体均购自美国Abcam；脂质体LipofectamineTM2000 购自美国Invitrogen；bradford 蛋白定量试剂盒购自北京百泰克生物；CCK8 购自日本同仁研究所；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒购自南京凯基；酶标仪购自美国Bio-TEK；FACSar 流式细胞仪购自美国BD。

1.2 细胞培养及siRNA 转染 SK-OV-3 细胞在5%体积分数的CO2培养箱中用RPMI1640 完全培养液（含有10%小牛血清及双抗）中37 ℃传代培养。取生长至对数期的SK-OV-3 细胞，以每孔1×105个细胞接种至6 孔细胞培养板，细胞达70%生长融合时，更换培养液（不含有血清和抗生素），参照脂质体LipofectamineTM2000 转染说明进行转染，将合成的无干扰作用的siRNA（阴性对照组，NC组）和合成的靶向抑制FGFR3 的siRNA（si-FGFR3组）转染SK-OV-3 细胞，并设置对照组（Control 组，加入脂质体），培养箱内孵育5～6 h，更换培养液（含有血清不含抗生素），继续培养48 h 收集细胞及蛋白裂解液，用于实验。siRNA 设计合成均委托广州锐博生物完成。FGFR3 的siRNA 序列，sense 5′-CGACAAGGAGCTAGAGGTT-3′，antisense 5′-AACCTCTAGCTCCTTGTCG-3′，阴性对照组siRNA 序列，sense 5′-ACAACTGCCTGGTTGGCAA-3′，antisense 5′-TTGCCAACCAGGCAGTTGT-3′。

1.3 Western blot 检测胰酶消化细胞，预冷的PBS 洗涤细胞，加入适量的RIPA 裂解液，4 ℃超声粉粹后，离心，收集上清，上清即为提取的全细胞蛋白，Bradford 法对蛋白进行定量。取蛋白50 μg按比例与2×SDS loading buffer 混匀，于100 ℃煮沸变性5 min，每泳道上样50 μg 变性蛋白，经12%的SDS-PAGE 电泳分离，电泳结束后电转移胶至NC膜，室温条件5%脱脂奶粉封闭膜1 h，洗膜，加入稀释好的FGFR3、B7-H1、p-NF-κB（S536）、p-IκB（S36）、cyclinD1、survivin 和内参GAPDH 抗体（按照1∶500～1 000 稀释），4 ℃摇床孵育过夜，洗膜，加入HRP 标记的二抗，室温孵育2 h，ECL 显色液避光显色，凝胶图象分析系统进行吸光度扫描，凝胶自动分析软件进行分析。以p-NF-κB 以NF-κB 为内参、p-IκB 以IκB 为内参，FGFR3、B7-H1、p-NFκB、p-IκB、cyclinD1、survivin 以内参GAPDH 为内参，以目的蛋白与内参蛋白的吸光度比值作为各蛋白的相对表达量。

1.4 细胞活力CCK8 法检测取对数期的SK-OV-3 细胞，以每孔5 × 103个细胞接种于6 孔板，每孔中加入2 mL，培养箱内常规培养24 h，以进行同步化处理，参照1.2 方法将NC 组和si-FGFR3 组转染细胞，并设置空白对照组及空白对照孔，每组设置5 个重复孔，在转染的24、48 和72 h 每孔中加入CCK8 10 μL，以空白对照孔调零，酶标仪测定吸光度值（OD值，570 nm）。实验重复3 次。

1.5 细胞凋亡AnnexinV-FITC 和PI 双染法检测胰酶消化按照1.2 分组转染48 h 的各组细胞，收集1 × 106个细胞，制备成单细胞悬液，PBS 洗涤，离心，在沉淀中加入500 μL 的Binding buffer 悬浮细胞，混匀后分别加入AnnexinV-FITC 和PI 各5 μL，4 ℃避光放置10～15 min，上机，行流式细胞术检测。实验重复3 次。

1.6 统计学方法所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料用表示，多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 si-FGFR3 转染SK-OV-3 细胞效果对照组、NC 组和si-FGFR3 组FGFR3 的蛋白表达分别为（0.271 ± 0.035）、（0.289 ± 0.036）、（0.081 ± 0.010），与对照组比较，si-FGFR3 组FGFR3 的表达显著降低（P＜0.05），而在NC 组的表达无显著变化（P＞0.05）。见图1。

图1 质粒转染SK-OV-3 细胞后细胞中FGFR3 的蛋白表达Fig.1 Protein expression of FGFR3 in cells after transfecting SK-OV-3 cells with si-FGFR3

2.2 si-FGFR3 转染降低SK-OV-3 细胞活力如表1所示，与NC 组比较，si-FGFR3 组在3 个时间点的细胞活力均显著降低（P＜0.05）。

2.3 si-FGFR3 转染促进SK-OV-3 细胞凋亡对照组、NC 组和si-FGFR3 组的细胞凋亡率分别为（2.34±0.46）%、（2.51±0.47）%、（16.88±0.99）%，与NC 组比较，si-FGFR3 组的细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。见图2。

表1 si-FGFR3 转染降低SK-OV-3 细胞活力Tab.1 si-FGFR3 transfection reduces the activity of SK-OV-3 cells ±s

注：与NC 组比较，*P ＜0.05

组别对照组NC 组si-FGFR3 组细胞相对活力24 h 0.478±0.039 0.462±0.037 0.301±0.028*48 h 0.791±0.082 0.784±0.080 0.516±0.054*72 h 1.018±0.093 0.997±0.089 0.703±0.069*

2.4 si-FGFR3 转染降低SK-OV-3 细胞B7-H1 表达对照组、NC 组和si-FGFR3 组B7-H1 的蛋白表达分别为（0.351 ± 0.039）、（0.366 ± 0.042）、（0.123± 0.015），与NC 组比较，si-FGFR3 组B7-H1 的蛋白表达显著降低（P＜0.05）。见图3。

图2 si-FGFR3 转染促进SK-OV-3 细胞凋亡Fig.2 si-FGFR3 transfection promotes apoptosis of SK-OV-3 cells

2.5 si-FGFR3 转染下调SK-OV-3 细胞NF-κB 信号对照组、NC 组和si-FGFR3 组p-NF-κB 的蛋白表达分别为（0.142 ± 0.015）、（0.158 ± 0.017）、（0.034 ± 0.006），p-IκB 的蛋白表达分别为（0.047± 0.008）、（0.062 ± 0.009）、（0.123 ± 0.014），cyclinD1 的蛋白表达分别为（0.766 ± 0.069）、（0.771± 0.067）、（0.326 ± 0.042），survivin 的蛋白表达分别为（0.263 ± 0.026）、（0.272 ± 0.028）、（0.153 ±0.020），与NC 组比较，si-FGFR3 组p-NF-κB、cyclinD1 和survivin 的表达均显著降低（P＜0.05），p-IκB 的表达显著升高（P＜0.05）。见图4。

3 讨论

FGFR 家族为跨膜酪氨酸激酶受体糖蛋白，FGFR3 属于FGFR 家族，定位于人类4p16.3，多种肿瘤中FGFR3 出现异常表达，其表达异常可引起所介导的途径发生异常，引起细胞分裂异常，进而可能促进肿瘤的发生发展［5］。而有研究显示，抑制FGFR3 表达可能降低肿瘤的发展进程。如多发性骨髓瘤中抑制FGFR3 表达可诱导细胞的凋亡［6］；胃癌中抑制FGFR3 表达可降低癌细胞增殖及促进凋亡，并可增加顺铂的化疗敏感性［7］。FGFR3对卵巢癌的影响目前研究的较少。有研究发现FGFR3 在卵巢癌中表达上调，抑制FGFR3 表达可降低癌细胞增殖，敲减FGFR3 表达可降低卵巢透明细胞癌的增殖和迁移［3，8］。但FGFR3 对卵巢癌细胞凋亡及机制研究的尚未清楚。

RNA 干扰是一种能降解特定基因mRNA 的细胞反应过程，目前该技术已被广泛的应用于癌基因的研究，并取得了对癌基因的RNA 干扰，这为基因功能研究及肿瘤的防治提供了新的思路及方法［9］。本研究中将合成的干扰FGFR3 表达的siRNA 转染卵巢癌细胞，细胞中FGFR3 的表达明显降低，且可有效降低癌细胞的活力及促进细胞的凋亡。B7-H1 是B7 家族中的一员，是一种重要的负性协同刺激分子，可介导肿瘤发生免疫逃逸［10］。有研究显示，卵巢癌细胞B7-H1 出现高表达，但引起其升高的机制还未完全清楚，在卵巢癌细胞与巨噬细胞非接触共培养后，可发现两种细胞B7-H1 表达较非培养组均明显升高，而抑制NF-κB 等信号通路后B7-H1 表达被抑制［11］。作为信号传导途径中的枢纽，NF-κB 与免疫、细胞凋亡调节及肿瘤发生发展等存在密切联系，因此在治疗肿瘤中NF-κB 可能是一个新的靶点。NF-κB 的活化是一个复杂过程，当结合NF-κB 的多个位点受到活化因素刺激后，NF-κB 被激活，IκB 发生磷酸化，磷酸化的IκB 与NF-κB 分离，NF-κB 快速入核而后行使转录因子功能，诱导一些靶基因的表达，如cyclinD1、survivin 等［12］。有研究显示，阻断NF-κB 的活化可明显抑制卵巢癌细胞增殖［13］。本研究检测磷酸化的NF-κB 和IκB 及靶基因cyclinD1 和survivin 的表达，发现抑制FGFR3 表达后卵巢癌细胞中p-NF-κB、cyclinD1 和survivin 的表达均明显降低，p-IκB 表达升高，这提示FGFR3 可通过下调NF-κB 信号影响卵巢癌的发生发展。