长链非编码RNA 癌易感性候选基因2 在卵巢癌中的表达及其对SKOV3 细胞恶性表型的影响

张素仙 聂小凤 张琴 冷天艳 杨丽华

昆明医科大学第二附属医院妇科（昆明650101）

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，在女性生殖系统恶性肿瘤中排名第二，但其病死率却位居妇科肿瘤之首［1］。卵巢癌对女性的健康和生命带来了严重的威胁，但卵巢癌的发病机制目前仍不清楚，因此探索卵巢癌的发病机制具有重要的临床及科研意义。LncRNA 是一类长度＞200 个核苷酸的内源性非编码单链RNA，在肿瘤发生、发展等生物学过程中发挥重要的调节作用［2］。近年发现，近18%的人类lncRNA 与肿瘤相关［3-5］。LncRNA 癌易感性候选基因2（Cancer susceptibility candidate 2，CASC2）是BALDINU 团队2004年在子宫内膜癌中首次发现［6］，其发现CASC2 通过可变性剪切形成3个转录变异体，分别为CASC2a、CASC2b 和CASC2c［7］。目前有研究［8］报道，lncRNA CASC2 在宫颈癌、非小细胞肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌、肾细胞癌、膀胱癌、神经胶质瘤、甲状腺癌等许多人类肿瘤中起了重要作用。在卵巢癌中作用如何未见报道，本研究拟探讨CASC2 在卵巢癌组织中的表达及对卵巢癌细胞生长的影响。

1 材料与方法

1.1 组织样本 收集2015年9月至2017年9月昆明医科大学第二附属医院妇科18 例上皮性卵巢癌（13 例高级浆液，2 例低级浆液性，1 例粘液样，1 例子宫内膜样和1 例透明细胞癌）患者肿瘤组织和对应的正常组织，组织立即在液氮中冷冻并在-80 ℃保存。没有一个患者接受过化疗或放疗。这项研究得到了当地伦理委员会的批准，所有患者都获得了知情同意。

1.2 上皮性卵巢癌细胞和正常卵巢上皮细胞5 株人卵巢癌细胞株A2780，Caov3，HO8910，SKOV3和OVCAR3 和人正常卵巢上皮细胞HOEpiC 购自中国科学院细胞库。细胞用含双抗和10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液于37 ℃培养箱中，5%CO2浓度下培养。

1.3 实验试剂 pc DNA3.1 质粒、pcDNA-CASC2真核表达载体、脂质体2000 、Trizol 试剂盒、qRTPCR 试剂盒购自赛默飞世尔科技公司。Annexin V/PI 凋亡检测试购自剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，兔抗Bax、BCL-2 单克隆抗体、GAPDH 多克隆抗体购自博奥森，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠及鼠抗兔二抗购自艾杰生物科技有限公司。

1.4 细胞培养和转染 人卵巢癌细胞SKOV3 用含100 mL/L 胎牛血清的RPMI 1640 培养基，置于37 ℃、50 mL/L CO2细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞接种于6 孔板，适量细胞接种在25 mm2培养皿中，24 h 后按照操作手册应用脂质体2000将pcDNA-CASC2 重组质粒、pc DNA3.1 空质粒转染入SKOV3 细胞。转染后细胞分别命名为pcDNACASC2、pcDNA 细胞。

1.5 RNA 分离和定量实时PCR（qRT-PCR）检测 根据试剂盒说明用Trizol 试剂从组织和细胞中提取出总RNA，使用qRT-PCR 试剂盒通过RNA和逆转录酶合成cDNA，应用qRT-PCR 检测CASC2表达，以GAPDH 为对照。CASC2 引物正向链5′-TACAGGACAGTCAGTGGTGGTA-3′，反 向 链5′-ACATCTAGCTTAGGAATGTGGC-3′；PCR 结果是用2-ΔΔct 方法计算。

1.6 细胞增殖 MTT（四甲基偶氮唑盐）检测细胞活力 取转染后SKOV3 细胞，调整细胞密度为5 ×103/mL，分别接种于96 孔培养板中，每孔100 μL。转染48 h 后MTT 法检测细胞增殖情况，实验独立重复3 次。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集转染48 h 后的各组细胞，用预冷的PBS 洗涤细胞2 次，分别加入5 μL Annexin V/FITC 和10 μL 20 μg/mL 的PI 溶液染色，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%，实验独立重复3 次。

1.8 Western blot 检测Bcl-2、Bax 蛋白表达 收集转染48 h 后的各组细胞，裂解后提取总蛋白。4 ℃下14 000 rpm 离心，收集上清液，进行SDSPAGE 电泳。电泳后转至PVDF 膜后封闭60 min。加入稀释的（1∶1 000）抗Bcl-2、Bax 蛋白的抗体，4 ℃过夜，PBS 洗膜5 min×3 次。再加入稀释的（1∶2 000）辣根过氧化物酶标记的二抗室温培育60 min，PBS 洗膜5 min×3 次。发光剂加于PVDF 膜上，暗室曝光显示条带。用Image 对条带灰度进行检测，并计算相应灰度值。

1.9 统计学方法 所有数据采用SPSS 18.0 进行统计分析，各组数据采用（）表示，各组间比较采用方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA CASC2 在卵巢癌组织中的表达PCR 方法检测18 例卵巢癌组织和癌旁正常组织LnCRNA CASC2 水平，卵巢癌组织组CASC2 水平显著降低，见图1（P＜0.01）。

图1 上皮性卵巢癌组织LnCRNA CASC2 表达水平Fig.1 The expression of LnCRNA CASC2 in epithelial ovarian cancer

2.2 LncRNA CASC2 在上皮性卵巢癌细胞株中的表达 与人卵巢上皮细胞株HOEpiC 相比，上皮性卵巢癌细胞株A2780，Caov3，HO-8910，SKOV3和OVCAR3 中CASC2 mRNA 表达显著降低，见图2（P＜0.05）。

图2 上皮性卵巢癌细胞株LnCRNA CASC2 表达水平Fig.2 The expression of LnCRNA CASC2 in epithelial ovarian cancer cell lines

2.3 pcDNA-CASC2 上调SKOV3 细胞CASC2 mRNA 表达 pcDNA-CASC2 载体转染SKOV3 细胞后48 h，抽提细胞总RNA，qRT-PCR 检测细胞CASC2 mRNA 表 达 水 平，发 现pcDNA-CASC2 组CASC2 mRNA 表达明显上调，见图3（P＜0.05）。

图3 pcDNA-CASC2 上调SKOV3 细胞CASC2 mRNA 表达Fig.3 The expression of CASC2 mRNA upregulaed by pcDNA-CASC2 in SKOV3 cells

2.4 LncRNA CASC2 对SKOV3 细胞增殖的影响MTT 法检测LnCRNA CASC2 对SKOV3 细胞增殖能力的影响，发现pcDNA-CASC2 上调SKOV3 细胞CASC2 mRNA 表达后细胞增殖能力降低，见图4（P＜0.05）。

图4 LnCRNA CASC2 对SKOV3 细胞增殖的影响Fig.4 The effect on SKOV3 cell proliferation by LnCRNA CASC2

2.5 LncRNA CASC2 对SKOV3 细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测CASC2 对SKOV3 细胞凋亡的影响，发现pcDNA-CASC2 上调SKOV3 细胞CASC2 mRNA 表达后，细胞凋亡率显著增加，见图5（P＜0.05）。

2.6 LncRNA CASC2 对SKOV3 细胞侵袭能力的影响 Matrigel-Transwell 小室实验检测LnCRNA CASC2 对SKOV3 细胞侵袭能力的影响，发现pcDNA-CASC2 上 调SKOV3 细 胞CASC2 mRNA 表 达后，穿过小室的细胞数目减少，侵袭能力细胞降低，见图6（P＜0.05）。

2.7 LncRNA CASC2 对SKOV3 细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响Western blot 检测结果显示pcDNA-CASC2 上 调SKOV3 细 胞CASC2 mRNA 表达后，Bcl-2 表达降低、Bax 表达增高，见图7（P＜0.05）。

3 讨论

自2004年BALDINU 团队在子宫内膜癌中首次发现lncRNA CASC2 后，在越来越多的肿瘤中均发现了lncRNA CASC2 的作用，其在各种肿瘤中均发挥抑癌基因的作用，但在不同肿瘤中其机理不尽相同。如FENG 等［8］发现CASC2 在宫颈癌组织中表达降低，其低表达与患者较短的生存时间、较差的临床病理特征相关，并认为其通过与miR-21的结合能够上调PTEN 表达，增强宫颈癌对顺铂的敏感性。HUANG 等［9］报道CASC2 在大肠癌的组织和细胞中表达下调，并通过竞争miR-18a 调节PIAS3 mRNA 的表达，从而发挥抑制肿瘤进展的作用。GAN 等［10］报道CASC2 在肝癌组织和细胞系中表达下调，过表达CASC2 可以降低肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，并通过失活MAPK 信号通路促进细胞凋亡。ZHOU 等［11］报道CASC2 通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）通路从而抑制胃癌细胞增殖、侵袭和血管生成。

图5 LnCRNA CASC2 对SKOV3 细胞凋亡的影响Fig.5 The effect on SKOV3 cell apoptosis by LnCRNA CASC2

图6 LnCRNA CASC2 对SKOV3 细胞侵袭能力的影响Fig.6 The effects on SKOV3 cell invasiveness b y LnCRNA CASC2

图7 LnCRNA CASC2 对SKOV3 细胞Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响Fig.7 The effect on bcl-2 and Bax protein expression in SKOV3 cells by LnCRNA CASC2

在本实验中，通过RT-qPCR 检测发现CASC2a在卵巢癌组织及卵巢癌细胞中低表达，一定程度上说明CASC2 与卵巢癌病理过程的相关性。在此结果的基础上，笔者继而研究了CASC2 对卵巢癌细胞生物学特性的影响，利用增殖实验、迁移实验发现CASC2 表达水平的升高可以抑制卵巢癌细胞SKOV3 的增殖和迁移。细胞学实验进一步证明了CASC2 与卵巢癌的相关性，说明CASC2 在卵巢癌的病理过程中发挥抑癌基因的作用。该结果与CASC2 在宫颈癌、大肠癌、肝癌等中发挥抑癌基因的作用相似，CASC2 在卵巢癌组织和细胞中的表达及对卵巢癌细胞生物学特性的影响为首次报道，提示CASC2 在卵巢癌的发生、发展中可能发挥着重要的抑癌基因作用，但其具体作用机制仍需进一步研究。

笔者同时应用Western blot 检测卵巢癌细胞CASC2 水平变化后Bax、Bcl-2 水平，发现CASC2 水平增加后Bcl-2 表达降低，Bax 表达增高。Bcl-2、Bax 属于Bcl-2 基因家族成员，被认为是调节细胞凋亡的关键因子。Bax 具有诱导线粒体渗透性改变释放细胞色素C、激活促凋亡蛋白Caspase-9，而表现出促细胞凋亡作用。Bcl-2 能够增强线粒体膜电位，抑制钙离子的释放，从而发挥抗凋亡作用。有较多的研究提示Bcl-2 蛋白的功能不仅局限于调控细胞死亡，其在调节细胞迁移、侵袭和肿瘤转移中也发挥着重要作用［12］。本研究中CASC2水平增加后Bcl-2 表达降低，Bax 表达增高，与流式细胞仪检测的过表达CASC2 后卵巢癌细胞凋亡降低、侵袭实验检测的侵袭能力减弱结果一致，进一步说明CASC2 在卵巢癌中可发挥抑癌基因的作用，可能可作为卵巢癌预后或治疗的靶点，值得进一步研究。