羌活桂枝膏联合推拿对兔膝骨关节炎滑膜中IL-1 及MMP-9 表达的影响

陈莹 薛明新 吕建军 周帅 宋石龙

1南京中医药大学附属医院（南京210000）；2南京医科大学第一附属医院（南京210000）；3南京中医药大学沭阳附属医院（江苏沭阳223600）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种广泛流行且进展缓慢的退行性疾病，多累及膝、髋负重活动关节，病理基础以关节软骨渐进性退化，伴有骨赘生成、渐进性关节功能丧失和软骨下骨重塑为特征，属于中医“骨痹”范畴［1-2］。膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）男性发病率为13.2%，女性发病率为28.3%，已经成为最常见和最重要的关节疾病，同时据流行病学调查统计，膝关节骨性关节炎的发病率随年龄增高而增高，40岁以下人群的发病率约为5%，60～75岁人群的发病率高于50%，50 岁以上骨关节炎患者的长期致残率名列第二［3］。有研究［4］表明我国目前症状性膝骨关节炎的患病率高达为8.1%。目前常见的治疗药物有非甾体抗炎药、IL-1 抑制剂等［5］，其缓解疼痛效果好，但其副作用却却不可小觑，有报道［6］称美国每年因非甾体消炎药导致死亡和住院总人数超过16 500人。近年来机制研究表明，白介素1（IL-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）与骨关节炎关节软骨的退变关系密切。羌活桂枝膏是笔者导师多年治疗膝骨关节炎的经验总结而成，具有祛风寒，除湿邪，温经脉的功效。本实验通过免疫组化半定量分析检测羌活桂枝膏联合推拿手法对兔膝骨关节炎滑膜IL-1 及MMP-9 的表达，进一步探讨羌活桂枝膏联合推拿手法的作用机理，为该方进行新药开发研制、走向市场提供一定的实验参数，同时为羌活桂枝膏联合推拿手法治疗KOA 提供实验支持。具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性新西兰大白兔（平均兔龄为8 个月，平均体质量2 kg）40 只，南京江宁区青龙山动物繁殖厂提供，符合卫生部一级实验动物标准（动物许可证号scxk（苏）2012-0008）。实验前词养1 周，观察无明显全身疾病及其他异常后开始实验。大白兔均饲养于室温22～25 ℃，12/12 h 昼夜节律，自由进食与饮水。

1.2 实验药物 羌活桂枝膏，江苏省中医院制剂部制备。药物组成：羌活、桂枝。桂枝、羌活饮片均购自于江苏省中医院药学部，经检验符合中华人民共和国药典2015 版一部之要求。

1.3 主要试剂及仪器设备 木瓜蛋白酶（美国SIGMA），ELISA试剂盒（美国R&D），NO测定试剂盒（中国A012），自动脱水机（中国JJ-12J），石蜡切片机（中国RM2016），摊片烤片机（中国KD-P），组织包埋中心（中国JB-P5），光学显微镜（日本Nikon Eclipse CI），电热恒温培养箱（中国HPX-9052MBE）图像采集系统（日本Nikon DS-U3），离心机（中国京立LD25-2），酶标仪（瑞士TECAN），免疫组化试剂盒（中国MaxVisionTM），DAB显色试剂（中国MaxVisionTM）。

1.4 研究设计

1.4.1 动物模型 40 只兔按随机数字表法分为分为正常对照组、模型组、推拿组、羌活桂枝膏贴敷、羌活桂枝膏联合推拿组5 组，每组8 只。分别将0.5 mL 的2%木瓜蛋白酶水溶液于实验开始第1、4、7 天注入兔右后肢膝关节制备家兔KOA 模型。造模结束1 周后，检验模型组造模成功与否，造模成功标准：兔膝关节造模侧出现肿胀，屈伸功能障碍为造模成功。

1.4.2 干预方法 正常对照组正常饲养，不做任何干预；模型组造模后正常饲养，固定右膝关节3 h；羌活桂枝膏贴敷组将羌活桂枝膏外敷于兔右膝关节，厚度约2 mm，面积3 cm × 5 cm，关节固定3 h，每日1 次；推拿组揉兔右膝关节髌骨周围，点按兔右膝委中、阳陵泉、曲泉、犊鼻、足三里等穴位共约5 min，最后擦兔右膝关节，透热为度，共计10 min，手法刺激以局部皮肤微红为度；羌活桂枝膏联合推拿治疗组先将将羌活桂枝膏均匀涂抹于兔右膝关节周围，使药膏充分透皮吸收；揉兔右膝关节髌骨周围，点按兔右膝委中、阳陵泉、曲泉、犊鼻、足三里等穴位共约5 min，最后擦兔右膝关节，透热为度，共计10 min，手法刺激以局部皮肤微红为度。

1.4.3 标本采集与预处理 滑膜采集实验结束前禁食禁水12 h，于治疗结束后的第2 天，大体观察各组实验动物的膝关节屈伸活动度及关节肿胀情况。留取的右膝关节，以内侧切口缓慢打开膝关节腔行大体观察，切取右膝关节滑膜，通过HE 染色方法观察病理组织；使用IHC 法测定IL-1 及MMP-9 含量。

1.4.4 指标检测与方法 造模成功后观察各组兔的精神状态、体毛色泽、饮食等，对兔右膝关节屈伸功能障碍程度及肿胀程度等情况进行评估。对滑膜组织行免疫组化IL-1 及MMP-9 半定量分析。

表1 桂枝羌活膏剂的性状检测结果Tab.1 Characters of Qiang Huo Guizhi ointment

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。实验结果以（）表示，符合正态性与方差齐性检验采用单因素方差分析，多组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物状态观察 从实验动物膝关节屈伸功能障碍程度及肿胀程度大体观察。膝关节屈伸功能障碍程度方面：正常对照组双侧膝关节屈伸活动度正常；羌活桂枝膏联合推拿组右侧膝关节屈伸稍受限，但活动度优于推拿组、羌活桂枝膏贴敷组及模型组；推拿组和羌活桂枝膏贴敷组右侧膝关节屈伸活动度相仿但优于模型组。膝关节肿胀程度方面：正常对照组双侧膝关节无肿胀；羌活桂枝膏联合推拿组右侧膝关节肿胀不明显，肿胀程度轻于推拿组、羌活桂枝膏贴敷组及模型组；推拿组和羌活桂枝膏贴敷组右侧膝关节肿胀程度相仿但优于模型组。

2.2 IL-1 半定量及免疫组化分析 见表2。IL-1在模型组、羌活桂枝膏贴敷组、推拿组的表达均较正常对照组升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），在正常对照组与羌活桂枝膏联合推拿组表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。IL-1 在羌活桂枝膏贴敷组、推拿组、羌活桂枝膏联合推拿组表达较模型组均有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。IL-1 在羌活桂枝膏联合推拿组相较羌活桂枝膏贴敷表达低，差异有统计学意义（P＜0.05）；在羌活桂枝膏贴敷组和推拿组表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。IL-1 在羌活桂枝膏联合推拿组治疗后的膝OA 兔滑膜与正常对照组兔滑膜表达水平相似，提示羌活桂枝膏联合推拿治疗膝OA兔疗效显著，对比单一推拿组及羌活桂枝膏贴敷疗效更佳。见图1。

2.3 MMP-9 半定量及免疫组化分析 见表3。MMP-9 在模型组、羌活桂枝膏贴敷组、推拿组、羌活桂枝膏联合推拿组的表达均较正常对照组升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；MMP-9 在羌活桂枝膏贴敷组、推拿组、羌活桂枝膏联合推拿组表达较模型组均有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。MMP-9 在羌活桂枝膏联合推拿组与推拿组表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；在羌活桂枝膏联合推拿组表达较羌活桂枝膏贴敷组低，差异有统计学意义（P＜0.05）。综上可见，MMP-9 在羌活桂枝膏联合推拿治疗后的膝OA 兔滑膜与模型组差异显著，提示羌活桂枝膏联合推拿治疗兔膝OA 有效，同时羌活桂枝膏贴敷组与推拿疗效相似。见图2。

表2 膝OA 兔免疫组化IL-1 半定量分析Tab.2 Semi-quantitative analysis of IL-1 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

表2 膝OA 兔免疫组化IL-1 半定量分析Tab.2 Semi-quantitative analysis of IL-1 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

注：与模型组相比，aP ＜0.05；与羌活桂膏贴敷组相比，bP ＜0.05

组别正常组模型组羌活桂枝膏联合推拿组羌活桂枝膏贴敷组推拿组例数8 8 8 8 8 IL-1 平均光密度43.985 1±9.927 9 122.132 5±10.081 7 52.468 7±4.142ab 77.170 1±11.407 3a 69.428 4±10.703 8a

3 讨论

3.1 祖国医学 骨痹之名始见于《内经》，《素问·痹论》有云：“风寒湿三气杂至，合而为痹。……以冬遇此者为骨痹。”，《灵枢·气穴论》记载：“积寒留舍，荣卫不居，卷肉缩筋，肋肘不得伸，内为骨痹。”，《济生方》曰：“骨痹之为病，应乎肾，其状骨重不可举，不遂而痛且胀。”可见骨痹病机为风、寒、湿邪困阻肌肉关节经脉，同时肾主骨，骨痹的发生，与肾关系密切。羌活桂枝膏是笔者导师凭借多年治疗KOA 的经验总结而成，组成为羌活及桂枝，羌活为伞形科植物羌活（Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang）的干燥根茎及根，归肾、膀胱经的功效，桂枝辛甘温，有温通经脉，助阳化气之功效。桂枝来源于樟科植物肉桂（Cinnamomun cassia Presl）的干燥嫩枝。其辛、温、甘，归心、肺、膀胱经，具有发汗解肌、温通经脉、助阳化气、平冲降气之功效。现代药理研究表明它有抑菌、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒、利尿、解热、镇痛、扩张血管等多种药理活性。桂枝是《伤寒论》中继甘草临床应用第二多的药物。两药相合，祛风寒，除湿邪，温经脉以治疗膝骨关节炎。

3.2 现代医学 现代研究表明骨关节炎中重要的病理学特征为——膝关节软骨细胞功能减退和数量减少、软骨基质减少。保持软骨细胞的健康状态是防止关节软骨退化的重要因素［7］。骨关节炎关节软骨的退变主要通过两条途径而发挥作用［8］：一是通过各种因素导致的细胞外基质的破坏；二是软骨细胞自身的退变，软骨细胞的凋亡。

图1 各组膝OA 兔滑膜IL-1 免疫组化Fig.1 Immunohistochemistry of IL-1 in synovium of knee OA rabbits

图2 各组膝OA 兔滑膜MMP-9 免疫组化Fig.2 Immunohistochemistry of MMP-9 in synovium of knee OA rabbits

本研究中，MMP-9 在羌活桂枝膏联合推拿治疗后的膝OA 兔滑膜与模型组差异显著，提示羌活桂枝膏联合推拿治疗兔膝OA 有效，同时羌活桂枝膏贴敷组与推拿组疗效相似。作为MMPs 家族的一员，有研究表明MMP-9 与的细胞外基质降解过程有关，并在病理过程为纤维化的疾病中起重要作用。细胞因子IL-1β通过刺激软骨细胞退变，引起基质金属蛋白酶（MMPs）家族的产生，抑制Ⅱ型胶原的合成［9-10］。

表3 膝OA 兔免疫组化MMP-9 半定量分析Tab.3 Semi-quantitative analysis of MMP-9 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

表3 膝OA 兔免疫组化MMP-9 半定量分析Tab.3 Semi-quantitative analysis of MMP-9 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

注：与模型组相比，aP ＜0.05；与羌活桂膏贴敷组相比，bP ＜0.05

组别正常组模型组羌活桂枝膏联合推拿组羌活桂枝膏贴敷组推拿组例数8888 8 MMP-9 平均光密度30.270 8±6.780 3 134.118 1±10.464 5 51.867 7±12.264 0ab 82.479 7±15.505 8a 73.650 3±7.915 2a

有研究报道称细胞程序性死亡——自噬，是骨关节炎中调节软骨细胞死亡的重要机制［11-12］IL-1为骨关节炎中主要的促炎症因子，体外研究［13］发现IL-1 能显著提高人软骨细胞其mTOR 的表达，而明显降低细胞外基质Ⅱ型胶原的表达，众多证据显示骨关节炎软骨退化伴有不同程度血管生成，源于关节软骨和滑膜液中VEGF 水平上升［14］，而mTOR 受体的激活可刺激血管内皮生长因子VEGF 的表达［15］，由此推断IL-1 可能在骨关节炎软骨细胞自噬过程中起到重要作用。同时IL-1β是诱导软骨细胞降解的始动因子，可以刺激基质金属蛋白酶（MMPs）的产生，导致软骨细胞肥大及细胞终末分化等细胞异化作用直接参与对软骨的破坏［16］。IL-1 在羌活桂枝膏联合推拿组治疗后的膝OA 兔滑膜与正常对照组兔滑膜表达水平相似，提示羌活桂枝膏联合推拿治疗膝OA 兔疗效显著，对比单一推拿组及羌活桂枝膏贴敷疗效更佳。

实验研究表明［17］：羌活膏能够降低局部滑膜中炎症因子来缓解膝骨关节炎的炎症，从而缓解膝关节骨性关节炎症状。同时李华南等［18］人通过临床研究发现：对患膝局部膏摩，能够促进药物吸收，直达病所，改善局部血液循环，使炎性反应加快消散吸收。

本研究结果初步证实了羌活桂枝膏联合推拿手法可膝关节骨性关节延缓膝关节软骨退变，降低炎性因子IL-1 及基质金属蛋白酶-9 的表达。而能否通过降低IL-1 水平，从而调节mTOR 受体，进一步抑制VEGF 表达，增加软骨细胞外基质合成、提高软骨细胞自噬、减少血管生成，协同作用以减缓骨关节炎进展承待进一步研究。