脐带间充质干细胞注射液治疗战创伤的疗效与机制研究

潘兴华，庞荣清，阮光萍，朱向情，蔡学敏，何 洁，赵 晶，刘高米洋，王金祥，吕燕波，李自安，王 强

作者单位：650032昆明，解放军920医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省干细胞工程实验室

脐带间充质干细胞（UCMSC）具有强大的抗炎能力，同时可通过定向迁移、定植分化和分泌细胞因子、外分泌体等多成份、多途径发挥协同作用和整体效应，能有效促进各种局部和全身性的组织损伤修复，提高组织细胞的自噬和自我修复能力，促进血管再生、组织细胞生长，减少细胞死亡，提升机体抗氧化应激能力等，这些作用和机制符合战创伤救治原则和要求，特别是对放射伤的基因和蛋白分子修复，对挽救高新技术武器伤伤员的生命和提高救治成功率有一定帮助[1]。

1 HUCMSC制剂规模化生产技术、质量和安全性研究

建立HUCMSC临床制剂生产所涉及的原材料筛选、采集、分离纯化、扩增、鉴定、储存、复苏和制剂生产、质量检验及标准、储存、运输、使用等基本技术，通过验证、优化建立完整的HUCMSC注射液的规模化、工厂化、标准化生产与储存技术体系。建立HUCMSC高效制备技术，每50 cm的脐带可制备出5代HUCNSC 6×1010个，达到临床1000例次以上治疗量，建成HUCMSC注射液中间产品（UCMSC）及终产品的中试规模生产、质量控制技术体系，达到产业化条件[2]。HUCMSC产品质量符合临床标准：（1）生长特性、细胞周期、形态、结构、功能和活性等指标符合UCMSC 鉴定标准；（2）CD29、CD44、CD90、CD105 阳性率大于90%，CD34、CD45为阴性；（3）可定向诱导分化为骨、软骨、脂肪、神经、胰岛及肝细胞样细胞，分化效率大于90%；（4）培养物、致热原、重金属等有害物质残留低于国家药典标准；（5）HBV、HCV、HIV、MCV 等病毒检测阴性，无细菌、支原体和衣原体污染；（6）T细胞增殖及干扰素分泌抑制率＞50%；（7）分泌多种生长因子和免疫调控因子；（8）抑制内毒素诱导的大鼠炎症反应，降低死亡率、抑制炎症水平和炎性细胞因子释放、减轻细胞死亡。建成规范化细胞储备库，制备储存HUCMSC 1.5万人份，达到年产HUCMSC注射液10万人份的能力。HUCMSC注射液的安全性符合临床制剂的安全标准[3]，在 1×106～1×107细胞/kg的剂量范围内，无急性过敏、溶血、免疫排斥反应和慢性毒性，无致瘤与促瘤性。分别按1×106～1×107细胞/kg的剂量，1次/2 w，连续8次，静脉注入UCMSC，持续观察半年，证实UCMSC在健康成年食蟹猴体内无长期残留、分布、定植及分化，不引起组织器官的结构与功能改变，免疫抑制效应在停用2 w后恢复正常，表明临床治疗量在1×107细胞/kg以下剂量范围具有安全性保障。

2 动物模型创建及疗效评价

采用机械损伤、化学诱导、血管栓塞、放射线照射等方法，创建了12类38种组织损伤模型，其中猕猴和树鼩模型有脑中动脉栓塞、后肢血管阻塞、颅脑损伤、外周神经挤压伤、全身性放射伤、系统性炎症、炎症性多器官功能不全、代谢综合征、老年退变、系统性红斑狼疮、肝损伤、胰腺损伤等。啮齿类、兔、犬等动物模型有心、肺、脑、肝、肾、胰腺、骨、皮肤损伤和糖尿病、代谢综合症、放射伤、创伤性系统性炎症、多器官功能不全、衰老等，这些动物模型反映了战伤中的组织损伤、炎症、血液循环障碍、器官功能不全等病理过程[4-5]。

根据UCMSC的安全剂量范围、疾病模型的种类和研究目的， 分别按 1×106细胞/kg、5×106细胞/kg 等剂量，1 次/w，连续1～3次；和隔日1次，连续1～3次的方式，静脉注入UCMSC。大脑中动脉栓塞、后肢血管栓塞和胰、肝、肾损伤等模型，按1×107细胞/次的细胞量，通过动脉血管介入，将UCMSC注射到损伤组织的血管内。UCMSC治疗后，进行动态检测或在特定时间点检测分析UCMSC的疗效，示踪UCMSC的定植、分化情况，观察组织器官的结构与功能变化，分析UCMSC的作用机制。根据UCMSC治疗后的行为、影像、组织、细胞、生化、免疫功能及疾病特异性指标等变化情况综合判定疗效[6-7]。主要疗效为：（1）对全身性放射伤、系统性炎症和炎症性多器官功能不全的疗效显著，表现为死亡率下降、存活时间延长、临床症状改善、组织内炎性细胞和致炎因子减少，炎症表现较轻，组织坏死减少，器官功能改善。（2）对缺血性疾病治疗，在早期阶段疗效明显，表现为缺血区组织坏死面积或体积减小，可促进血管再生和改善血液循环，神经功能恢复加快。对慢性缺血性组织损伤有一定疗效，主要表现为血管再生和一定程度的功能改善，但组织结构变化差异较大。（3）对于退变性疾病，可增强组织器官功能，提高心输出量、心脑血流灌注量、肾小球滤过率、纤维化程度降低和胶原含量下降等。（4）对代谢综合征可促进糖、脂代谢，表现为血糖、血脂含量降低，抑制动脉粥样硬化的发生发展。（5）对其他损伤性疾病可一定程度的改善组织器官结构和功能。

3 UCMSC治疗机制研究

3.1 UCMSC的标记及体内示踪 建立了超顺磁氧化铁粒子（SPIO）、强荧光蛋基因（eGFP）、4',6 二脒基 -2-苯基吲哚（DAPI）、5-溴脱氧尿嘧啶核苷 （BRDU）、 荧光素酶（Luc）基因等标记UCMSC技术，标记率达90%以上。SPIO标记的UCMSC可采用MRI在单细胞水平在体内示踪，无毒性作用，适用于人体内追踪UCMSC。eGFP、Luc基因标记可采用小动物活体成像体内示踪；采用组织荧光观察显示UCMSC在组织中的定位，并可采用免疫组织染色法分析UCMSC的分化情况。DAPI、BRDU标记法可通过化学显色法，显示UCMSC在体内的分布及增殖情况。建立了eGFP+SPIO、eGFP+BRDU等多重标记方法，可采用多种手段同时体内示踪UCMSC。

UCMSC在体内的分布有显著的组织差异性，成年猕猴静脉输入 5×106细胞/kg的 UCMSC后 2～4 h内，50%～60%的UCMSC滞留于血液和肺组织，如果有急性肺组织损伤时，肺组织滞留量增多，可达80%以上；随后4～24 h，主要分布于肝、脾、胰、肾髓质等血流较丰富的组织中，在骨髓组织中也有分布；在3～28 d内，上述组织中仍有UCMSC的分布，但呈逐渐减少趋势，到60 d时数量更为稀少。UCMSC具有损伤和炎症组织趋向性，且沿血管走向分布，损伤和炎症组织中的UCMSC分布在输入后4～24 h内呈增加趋势。UCMSC在免疫缺陷鼠体内存活时间大于120 d，供受者为同一品系大、小鼠的UCMSC治疗，在炎症和损伤组织中存活时间大约60 d；猕猴、食蟹猴同种异体UCMSC移植的存活时间为40 d，在骨髓组织中存活时间为76 d。而在健康动物体内的存活时间则大大缩短，在治疗28 d后，只有极少量细胞分布于肺、肝、肾、骨髓等组织。通过静脉内注射的UCMSC也能穿透血脑屏障进入缺血或机械损伤的脑组织，但数量相对较少，存活时间也不如局部注射长。在卵巢、睾丸组织中的分布于治疗2～8 d内有增加趋势，但增加数量不明显。UCMSC体内示踪显示[8-9]：（1）体内分布特点与其质量、数量、组织类型、损伤程度、血管分布、健康状态、移植途径等有关系，对损伤和炎症组织具有趋向性。（2）存活时间主要与种属、供受者间的遗传差异性、免疫功能状态、疾病类型有关，在免疫缺陷动物体内存活时间最长，遗传背景相同或相近的同种异体移植次之，异种间移植存活时间较短。（3）同种异体，甚至是异种间移植未见明显的急性免疫排斥反应，同时均有一定治疗作用。（4）组织分布数量及存活时限有一定量效关系，但与其疗效不成正比，在一些UCMSC分布较少，甚至无分布的组织损伤治疗中有明显疗效，说明UCMSC产生的细胞因子、外分泌体发挥了作用。

3.2 UCMSC的体内分化 在诱导培养条件下UCMSC可被诱导分化为神经、胰、骨、脂肪等18种组织类型的成熟细胞。将UCMSC移植于组织损伤动物体内，可迁移并定植于损伤组织中，被组织微环境诱导分化为相应组织的成熟细胞并整合于组织之中。UCMSC进入急性肝损伤动物模型的肝组织后，转化为表达CD19和分泌白蛋白的肝细胞样细胞。将SPIO和eGFP基因标记的UCMSC输入胰腺损伤猕猴体内，部分UCMSC定植于胰腺组织中并表达相应的表型标志和分泌胰岛素。eGFP标记的UCMSC进入心肌纤维化大鼠心肌组织中可转化为心肌细胞，使左心室的收缩力和心输出量显著增加。在肾缺血性损伤、慢阻肺、脑缺血、后肢缺血等模型治疗实验中，UCMSC可向相应组织细胞分化，表明UCMSC向损伤组织迁移、定植和分化是其治疗组织损伤的重要机制之一。

3.3 UCMSC的分泌作用 质谱分析发现，UCMSC培养液上清中含有468种蛋白成份，包括调节细胞生长、细胞功能、细胞过程及炎症调节等方面的因子，其中促进细胞生长的有 SCF、HGF、TGF、FGF、CSF 等 29 种，参与炎症与免疫调节的因子有42种，提示UCMSC在体内分泌的生长因子和炎症与免疫调节因子在组织损伤修复中发挥了重要作用。UCMSC的培养液上清中含有大量外泌体(UCMSC-exo),将其与氧化应激内皮细胞模型共培养,发现UCMSC-exo可提高模型细胞的自噬能力和抑制凋亡,说明UCMSC-exo有提高氧化应激内皮细胞的自我修复能力。UCMSC-exo携带有蛋白质和核酸等多种生物功能分子，特别是含有大量调节细胞修复、免疫与炎症及细胞抗衰老的miRNA，且有类似HUCMSC的功能

3.4 调控基因表达 采用高通量基因测序技术对幼年、中年、老年猕猴及UCMSC治疗的老年猕猴的外周血单个核细胞的全基因转录组miRNA进行深度测序并通过生物信息学聚类及进行比对分析，发现UCMSC主要调控细胞生长、衰老、炎症和分化相关基因的表达而发挥作用。随着年龄的增长，细胞生长相关基因表达减少，而炎症、衰老相关基因表达升高，UCMSC治疗后可有效促进生长相关基因表达并抑制炎症、衰老相关基因表达。通过对UCMSC治疗放射伤、慢性阻塞性支气管炎、系统性性炎症及代谢综合征的外周血和组织提取液进行蛋白组学分析，结果显示，UCMSC治疗可提高血液和组织中多种生长因子的含量，而使炎症因子、抗氧化应激因子的含量降低，结果与基因转录分析结果一致，对UCMSC治疗代谢综合征模型的血液和肝脏进行代谢组学分析，发现UCMSC可显著促进脂代谢功能，使血液和肝组织提取液中的脂类含量降低，该疗效可能源于UCMSC促进组织损伤的修复和再生[10]。

4 临床治疗研究启示

UCMSC的临床疗效与动物模型治疗实验结果基本一致：（1）对自身免疫和炎症性疾病的疗效显著，可明显缓解症状，改善器官结构与功能，部分病例可达到治愈效果。（2）对缺血性疾病疗效明显，在缺血性疾病的早期效果最好，可改善临床症状，影像学观察显示缺血面积减少，其疗效明可能与抑制炎症和促进缺血组织再生有关。（3）对于慢性支气管炎、器官纤维化、退行性变等慢性疾病，UCMSC治疗可改善临床症状和器官功能，这主要是UCMSC分泌的细胞因子和外泌体发挥作用的结果。（4）对急、慢性疾病及亚健康状态的UCMSC治疗发现一些惊奇的伴随现象，其中包括睡眠、饮食、精神状态、现容颜改善，围绝经期月经恢复等，说明UCMSC治疗具有促进整体功能的作用。UCMSC适用于战伤引起的缺血、炎症及组织变性、坏死等治疗。对于战伤后遗症治疗则需要利用计算机辅助设计、3D打印、体外培育等技术研发出具生物活性组织或器官进行移植治疗。