错配修复蛋白在结直肠癌中的表达及临床意义分析

张如意（通讯作者） 姚秀娟

（1浙江大学医学院附属第二医院病理科 浙江 杭州 310009）

（2嘉兴市第二医院病理科 浙江 嘉兴 314000）

结直肠癌是位居第3位的常见恶性肿瘤，其发病率逐年升高。结直肠癌至少起源于两条不同的遗传途径。其中一条途径与染色体不稳定（CIN）有关，另一条与微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）有关[1]。MSI显示出MMR缺失，故将其作为一种分子标记。MMR起稳定DNA的作用，在体细胞分裂时参与修复DNA复制过程中产生的特定复制错误。MSI肿瘤由于MMR缺陷，产生突变加速累积。结直肠癌中大约15%是由微卫星不稳定途径形成的， DNA复制过程中错配修复（mismatch repair，MMR）基因系统异常是MSI发生的原因[2]。MSI与DNA修复蛋白的表达减少有关，通常使用免疫组织化学检测MLH1，MSH2，MSH6和PMS2作为MSI标记。

在散发性结直肠癌中检测MMR可作为HNPCC初筛，并且可对指导治疗方案和预后方面具有重要意义。Dung T. Le等在2015年发现，传统治疗效果不理想的伴微卫星不稳定的结直肠癌晚期患者，在使用PD1抑制剂pembrolizumab时取得了惊人的效果，使得这类患者可接受肿瘤免疫治疗，因此开展结直肠癌MMR检测具有重要的临床意义[3]。本研究采用免疫组织化学方法对90例连续的结直肠癌患者检测MSH2、MSH6、MLH1和PMS2蛋白的表达，并观察其临床病理学意义。

1.材料和方法

1.1 材料

收集2016年—2017年嘉兴市第二医院病理科诊断为结直肠癌的病例90例。所有病例均经两位病理医师复诊。其中男性60例，女性30例，年龄30～88岁。左半结肠癌23例，右半结肠癌21例，直肠癌46例。71例高分化及中分化，19例低分化。浸润深度17例未达浆膜，73例侵及浆膜。29例有淋巴结转移，61例无淋巴结转移。

1.2 方法

组织学和免疫组化染色：标本均经10%中性缓冲福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋，连续切片，厚3～4μm，进行常规HE及免疫组化EnVision两步法染色，检测MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白表达，所有抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 结果判定

MMR蛋白定位于细胞核，细胞核着色判定为阳性，与染色强弱以及阳性细胞弥漫或局灶分布无关。细胞核不着色则判定为阴性。

1.4 统计学分析

实验数据采用SPSS19.0软件进行统计学分析，比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 MLH1、MSH2、MSH6和PMS2免疫组织化学表达缺失

对90例结直肠癌样本进行MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白免疫组织化学检测。MMR蛋白检测可出现4种异常蛋白丢失表达方式，即MLH1-PMS2-、MSH2-MSH6-、MSH6-和PMS2-。本研究90例结直肠癌中，11例发生MMR蛋白丢失表达（图1），其中8例MLH1-/PMS2-，1例MSH2-/MSH6-，2例PMS2-，以MLH1和PMS2蛋白表达缺失为主。MSH2、MSH6、MLH1、PMS2蛋白表达缺失率分别为1.1%（1/90）、1.1%（1/90）、8.9%（8/90）、11.1%（10/90）。

2.2 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表达与结直肠癌临床病理特征的相关分析（表1）

表1 MMR蛋白缺失表达与临床病理因素分析

结直肠癌组织中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表达缺失与患者年龄、性别、浸润深度、淋巴结转移无关（P＞0.05），缺失表达发生于右半结肠高于左半结肠和直肠（P=0.04），蛋白表达缺失与组织学分化高低相关（P=0.03）。

图1 直肠癌组织HE染色及MMR蛋白的阳性表达（定位在细胞核）

3.讨论

50～85%结直肠癌是由染色体不稳定途径发展而来，DNA错配修复引起MSI约占10～20%[2]。将一个错配修复基因如MLH1或MSH2敲除后导致遗传突变，引起的HNPCC占CRC少于5%。MSI通常是由于MLH1启动子散发性甲基化沉默引起[4]。本研究中dMMR在CRC中占12.2%（11/90），缺失表达发生于右半结肠高于左半结肠和直肠（P=0.04），蛋白表达缺失与组织学分化高低相关（P=0.03），这一数据与现有报道相比较一致。

本研究中不同MMR蛋白的缺失模式与其他报道相似，其中MLH1和PMS2最多，占的dMMR的72.7%。这一比率与其他报道相似。MLH1和PMS2同时缺失导致MLH1缺失突变和MLH1启动子散在甲基化沉默，其他的dMMR蛋白缺失仅与各自的DNA修复基因突变有关。MMR翻译时，有必要考虑MMR的二聚体关系。MSH2和MSH6结合形成MutSα异二聚体，识别并结合至错配碱基对，并且引起MLH1和MSH2结合形成的MutLα异二聚体修复错配碱基对。在MutLα和MutSα中，MLH1和MSH2是必须蛋白，而PMS2和MLH1是其相应的结合配体蛋白。MLH1和MSH2是PMS2和MSH6稳定所必须，MLH1或MSH2的缺失将引起其各自结合配体蛋白降解。相反，配体蛋白缺失并不影响必须蛋白，后者可与替代的次要蛋白结合成异二聚体[5]。因此，单独缺失PMS2和MSH6最可能引起各自错配基因的缺失突变。

2016年美国ASCO年会报告，肿瘤部位与Ⅲ∕Ⅳ期结直肠癌独立的预后有关，右半结肠相较于左半结肠和直肠死亡风险明显增高。本研究结果显示MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表达缺失与患者年龄、性别、浸润深度、淋巴结转移无关（P＞0.05），缺失表达发生于右半结肠高于左半结肠和直肠（P=0.04），也提示MMR蛋白表达状态与结直肠癌预后相关。

MMR缺失患者对5-氟尿嘧啶的辅助治疗效果不佳[6]。传统治疗效果不理想的伴微卫星不稳定的结直肠癌晚期患者，在使用PD1抑制剂pembrolizumab时取得了惊人的效果，使得这类患者可接受肿瘤免疫治疗[3]。综上所述，开展结直肠癌MMR检测对于判断预后及寻找有效治疗方法，具有重要的临床意义。