LRP-1信号传导调节血管生成的研究进展

贺朝晖综述，王 刚，罗 茂审校

（西南医科大学：1临床医学本科2016级；2药物研究中心；3四川省心血管疾病防治协同创新中心，四川泸州 646000）

低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（Low-density lipoprotein receptor-related protein-1,LRP-1）是LDL 受体家族中的一员，不仅参与了人体的脂质代谢过程，还与多种病理生理过程相关，如阿尔茨海默氏症、动脉粥样硬化、炎症和凝血等[1]。然而，LRP-1在内皮功能和血管生成方面的作用却有待研究。这是因为LRP-1在各种血管的内皮细胞（endothelial cells,ECs）中的含量很低，并且由于胚胎植入缺陷，LRP-1去除的小鼠是胚胎致死型的，需要另寻合适的基因敲除模型从而搁置了相关内皮功能方面的研究。研究表明，在ECs中，LRP-1表达是受动态调控的[2-4]。例如微血管内皮细胞内的LRP-1含量减少可以由缺氧和他汀类药物引起。在对LRP-1 使用的动物模型的研究中（如吗啉去除的斑马鱼和特定组织去除的小鼠），LRP-1 在EC 功能和血管生成方面的作用被首次发现。本文将主要讲述它在血管生成方面作用的研究进展，尤其是LRP-1 信号通路对各种内皮活动的调控作用（如增殖、迁移、渗透和血管生成）。

1 LRP-1的结构及细胞信号与胞吞作用

低密度脂蛋白受体家族成员具有相似的结构与组成，它们都含有各自的胞质域、单通道跨膜域和细胞外配体结合域[5]。早期的LRP-1 前体与一种受体相关蛋白（receptor-associated protein,RAP）在内质网中紧密结合从而阻止了它与配体的相互作用。只有当LRP-1前体（600 kDa）在转运高尔基体中被弗林蛋白酶所裂解产生一个515-kDa的α 链（LPR1α，拥有四个细胞外配体结合域，能与配体相互结合）和一个85-kDa 的β 链（LPR1β，在细胞质中以非共价结合的方式膜锚定）后，LRP-1 才能发挥信号传导的作用[6]。至今LRP-1已被发现能够与40多个不同的参与各种细胞活动的配体相结合。这些配体包括了脂蛋白和脂蛋白脂肪酶，蛋白酶及其复合物抑制剂，基质蛋白，细胞内蛋白（如RAP、生长因子等）等。作为一种胞吞受体，LRP-1通过内吞配体并将其传递给内体或溶酶体实现了胞外配体的胞内化。在与配体分离后，LRP-1 能够与选择链接蛋白17 结合回到细胞表面被循环利用[7]。同时，在LRP-1胞质端肽链上的YXXL模体、二亮氨酸模体和NPXY 模体在LRP-1 的内吞和循环中发挥了主要的信号传导作用[8]。

三种分子机制可以解释LRP-1如何调节信号通路来应对胞外刺激。第一种：作为信号复合物的胞吞受体，在LRP-1的帮助下，浆膜蛋白、淀粉样蛋白前体蛋白和尿激酶纤溶酶原激活剂受体（urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR）等直接内吞进入细胞[9]。LRP-1还可与血小板衍生因子（platelet derived growth factor,PDGF）受体结合，使得PDGF 受体被磷酸化从而被直接回收[10]。第二种：一些配体与LRP-1 结合产生间接作用来激活其内吞通道。例如，LRP-1 与组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，tPA）或α 2-巨球蛋白（α 2-macroglobulin,α 2M）等配体的结合使Src 家族激酶、Trk 受体、神经元胞质激酶Akt 和ERK 等激活，间接地实现内吞作用[11-12]。第三种：LPR1 的β 链可以被γ -分泌酶加工产生一个小碎片—LPR1 C 端胞内结构域（LRP-1 C-terminal intracellular domain,LPR1-ICD），LPR1-ICD可以从细胞质转移到细胞核并调节核信号传导。例如，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可诱导LRP-1 膜内水解产生LPR1-ICD 进入细胞核。核LRP-1-ICD 蛋白能够促使炎性转录因子、干扰素调节因子3（interferon regulated factor 3,IRF3）释放出核，从而减少了炎性基因的转录[10]。

2 LRP-1与血管生成

血管生成的过程是有序的、受严格控制的，它分为血小管生成（vasculogenesis）和血管生成（angiogenesis）[13]。与血管生成不同的是，血小管生成是原始血管网络的形成，而血管生成是一种已建立的毛细血管网的重塑过程，通常是由先前存在的血管系统产生新的毛细血管。血管生成通过五个主要步骤进行：基底膜和周围细胞外基质的选择性降解、ECs迁移、ECs增殖、血管的形成、血管网络的重塑。在严格调控的血管生成过程中，促血管生成信号如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、血管生成素、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors,FGF）、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)、尿激酶纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)等和抗血管生成信号（如管生成抑制素、血管内皮抑制素等）之间的平衡是新血管生成的必需条件。失控的血管生成会导致视网膜病变、恶性肿瘤等病理状态。

近年来，越来越多的研究表明，LRP-1 在微血管和毛细血管ECs中表达并参与了内皮功能的调节，如血脑屏障的转胞吞作用、通透性调节和血管生成。在斑马鱼中LRP-1 的表达主要局限于血管生成的区域，而LRP-1 的去除会导致其腹腔棘突和尾静脉网的形成缺陷[14]。在小鼠发育过程中，LRP-1 的mRNA 信号在E9.5-12.5 中普遍分布。它的对应蛋白可在发育中的高度血管化的器官（如大脑、心脏和肝脏）中被检测出来。当LRP-1 在小鼠胚胎中被去除时，会检测到血管发育缺陷，如血管破裂、内皮细胞被阻断和大出血[15]。在氧诱导视网膜病变的小鼠模型中，ECs中的LRP-1消耗引起了视网膜新生血管的增加。缺乏内皮LRP-1的视网膜中可见内皮细胞增生和血管新生幼芽的增加[2]。此外，LRP-1还通过促进MMP2 和MMP9 的表达、AKT 和EphA2 激活和形成板状伪足参与调控了癌细胞的迁移和侵袭。

3 LRP-1与BMP信号传导

骨形成蛋白（Bone morphogenetic proteins,BMP）是TGFβ 家族蛋白中的一员,在细胞增殖、分化、运动和附着等活动中有着重要作用[15]。BMP 受体、BMPs 及其下游介质Smads 的无效突变引起了各种动物模型的血管发育缺陷，这体现出了BMP信号在血管形成中的重要作用。BMP信号通路受到细胞外调节因子的严格调控，如BMP 结合内皮调节因子(BMP-binding endothelial precursor-derived regulator,BMPER）。BMPER在胚胎血管和肿瘤侵袭的发展过程中起着关键作用。在ECs 中，BMPER 和BMP4 的化学计量比是BMP4 信号被BMPER 激活或抑制的决定性因素。研究表明，LRP-1 是BMPER 的一个结合伴侣，是BMPER 内化和BMP4 信号化的必要条件[14]，LRP-1 通过与BMP 的I 型受体ALK6 相互作用，充当了BMP 的一种辅助受体。BMPER/BMP4 受体复合物的具体组成包括BMPER、BMP4、ALK6、BMPRII 和LRP-1，它受BMP 和BMPER 的化学计量比与LRP-1 活性的动态调节[16]。对BMPER的促BMP 和抗BMP作用来说，LRP-1介导的BMP和BMP信号复合物的内吞作用都是必需的[16]。许多BMP 信号的调节因子都有一个跨越多个细胞的空间梯度效应。总之，LRP-1 介导的BMPER/BMP/BMPR信号复合物的胞吞作用揭示了一个单细胞水平的分子机制。

在斑马鱼中LRP-1 的降低会导致异常血管表型的产生，表现为背侧和节间的血管畸形，尾静脉丛内血管分支减少和血管腔肿胀[14]。而血管缺陷同时可能引起LRP-1 去除鱼的血流受阻、心跳减慢或心跳停止的现象。此外，LRP-1缺乏鱼在静脉发育过程中腹侧出芽的情况较少。LRP-1 去除鱼胚胎中Smad1/5/8 磷酸化的减少表明BMP 信号传导会被LRP-1 缺乏所抑制。这些均表明LRP-1 能够通过调节BMP信号从而调节血管生成。

4 LRP-1和PARP1

DNA 修复酶(poly ADP-ribose polymerases,PARP)在DNA修复、细胞凋亡、染色质调制和细胞周期调控等方面起着关键作用[17]。它将ADP-核糖单位从NAD+转移到受体蛋白或PARP 自身。PARP 抑制剂已被开发用于癌症治疗，而研究表明，PARP抑制剂也可以通过抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的产生来抑制VEGF 产物或VGEF/FGF-诱导细胞的增殖、迁移和成管来减少血管生成[18-20]。而LRP-1 在小鼠视网膜新生血管生成过程中能够通过与PARP-1 相互作用来抑制新血管生长[2]。这些现象表明LRP-1可以通过LRP-1-ICD的核内活动来调节内皮生长。通常，LRP-1-ICD 能够被LRP-1 调控的膜内蛋白水解加工，并存留于细胞核中。PARP-1 与LRP-1-ICD 结合后活性受到其抑制，这引起了有丝分裂前期细胞的分裂阻滞。在缺氧环境中，PARP-1和LRP-1形成的复合物分离，从而减少了LRP-1对PARP-1活性的抑制，反而加速了细胞周期进程、环素依赖性激酶2磷酸化和视网膜母细胞瘤及视网膜血管生成。这说明LRP-1-ICD 在核蛋白(如PARP-1和IRF3)的胞内转运过程中起着重要作用，而蛋白质水解产生的游离LRP-ICD很可能是这种机制的调控因子。

PARP-1通过加速细胞周期进程促进血管生成，在缺氧诱发的血管生成过程中，PARP-1 酶活性的增加，PARP-1出核增加，但PARP-1的活性变化是否与其出核活动有关仍有待研究。LRP-1-ICD的出核时是否需要与PARP-1分离同样是个谜团。LRP-1-ICD 最后的33 个氨基酸构成了PKA 的磷酸化位点和多亮氨酸模体并负责与PARP-1 的相互作用，然而，PKA 和多亮氨酸模体对两者相互作用和出核运动的影响仍不清楚。

5 LRP-1和S1P信号传导

1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）由鞘氨酸合成，主要分布于胞膜，是细胞生长、抗凋亡和细胞迁移等多种细胞代谢活动的重要信号分子[21]。S1P信号通路的失控与癌症、炎症、动脉粥样硬化等多种病理改变的产生有关[22]。S1P 与白蛋白、脂蛋白在血液循环中形成的复合物在血浆(0.2～1.1 μM)和淋巴液(0～0.1 μM)中含量十分丰富。一组G蛋白偶联受体充当了S1P受体的角色，当S1PR与不同类型的G蛋白结合，S1P调节的渗透、炎症、迁移和血管生成等内皮活动也不同[23]。S1PR1 主要与Gi 蛋白结合来激活磷脂酰肌苷-3-激酶和内皮一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)从而调节黏合带的完整性和粘着斑的动态组装。S1P2 和S1P3 同样可以与Gi、Gq/11 和G12/13 等多种G蛋白结合。在细胞内同样能检测到S1P 存在，但是细胞内S1P的确切作用仍不清楚。

LRP-1缺失的小鼠在胚胎中就表现出明显的血管缺陷，例如内皮完整性的破坏、平滑肌细胞层薄而排列紊乱，以及胚胎的大量出血[15]。Nakajima 等[15]发现，在MEFs 中LRP-1的消耗减弱了S1P 对PDGF-BB 诱导的RAC1 蛋白激活和细胞迁移的抑制作用，而LRP-1-ICD的过度表达能够矫正LRP-1 消耗所导致的这种异常。通过对百日咳毒素恢复S1P对PDGF诱导细胞迁移抑制作用的观察发现，S1P可能通过抑制Gi 蛋白激活来阻止PDGF 诱导RAC1 蛋白激活。此外，在人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelia cells,HUVECs）中观察到LRP-1 促进了S1P 对Gi 蛋白活性的抑制作用。这表明LRP-1 可能在S1P 和PDGF-BB 之间的相互作用以及内皮细胞迁移和血管生成过程中起着关键作用。然而，LRP-1 是如何促进S1P 信号的抑制作用（特别是对Gi-GTP水平的下调）并不清楚，也许LRP-1能与S1P/Gi 通路中的中介体相互作用，也许LRP-1 介导的胞吞作用能影响S1P 和PDGF-BB 在信号通路中的相互作用，但这些都有待研究。

6 LRP-1和uPAR–uPA–PAI-1信号通路

uPA、uPAR 和血纤维酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)在胞外蛋白酶水解过程中发挥了重要作用。被激活后，uPA启动一系列信号传导活动调节细胞粘附、迁移和凋亡，而一旦PAI-1 与uPA 和uPAR 形成复合物，LRP-1的结合会导致uPAR平均含量的降低。LRP-1是uPA诱导内皮渗透性改变的必要因素，虽然内皮渗透性在血管生成中的作用未完全清楚，但有种假说认为EC 的迁移需要内皮渗透性的增高[24]。许多血管生成因子(如VEGF)能快速引起血管通透性的变化(1～2 h)，这可能是由于eNOS的激活，NO的形成以及转胞吞作用的增强[25]。VEGF还能上调uPAR 含量同时降低闭合蛋白的含量，从而导致远期(6-24 h)渗透性的增加。抗uPA抗体和uPAR抗体均可阻止VGEF 诱导的渗透性增高。此外，外源性uPA 的加入增加了示踪分子的血管通量，表明uPA 能有效增加视网膜微血管ECs的通透性，这种由uPA介导的渗透性增加很可能是由于连接细胞的重新分配和电阻抗的下降。而RAP抑制LRP-1后导致了对uPA-PAI-1 介导的ECs 渗透性改变的抑制[26]。越来越多的证据表明LRP-1其实是uPA-PAI-1诱导Gs激活过程中的信号受体，它通过增加cAMP的含量来激活PKA和eNOS[27]。

LRP-1与VEGFR2、β 1-整合素和uPAR在ECs胞膜上形成了多受体复合物，受到VEGF 的作用，LRP-1 介导了该多受体复合物的内吞过程[28]。例如，LRP-1 的拮抗物RAP对LRP-1 的抑制作用能够阻止VEGFR2 的内化，进而抑制了VEGFR2 的磷酸化及其下游细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK)的激活。此外动力蛋白抑制剂dynasore对动力蛋白介导的胞吞作用的抑制同样能引起对VEGF 信号传导的抑制作用，这也表明了VEGF 的信号传导离不开LRP-1介导的胞吞作用。在VEGF诱导的EC迁移和HUVECs 增殖过程中，这种LRP-1 介导的胞吞作用被进一步证实起重要作用。而在多受体复合物的形成及胞吞过程中，uPAR和LRP-1的相互作用至关重要。目前的研究仅通过人工培养的初级ECs完成，要充分了解LRP-1在病理环境下对VEGF-VEGFR2-uPAR信号传导的作用仍待进一步的研究。此外，LRP-1 的作用仅通过其内化抑制剂RAP的应用进行了测试，而RAP同样能阻止其他LDLR家族成员与配体相结合[29]，导致了研究的局限，只有使用更精确的抑制方法（如引起LRP-1的缺失突变的基因抑制/基因敲除技术），才有助于阐明LRP-1 在内皮渗透性变化和VEGF 依赖性血管生成中的具体作用。

7 结论

LRP-1在血管生成中的重要作用近年来才被发现，由于LRP-1 促进了许多配体受体复合物的胞吞作用并参与了多种病理过程中生长因子及其它细胞因子的信号传导过程，因此LRP-1在调控ECs生长、迁移和成管过程中参与众多的信号传导通路的发现并不令人惊讶。在不同的血管生成模型中，LRP-1 的缺失造成了不同的后果，这很可能是由于LRP-1 介导的复杂信号级联网络引起的平衡效应或受到不同微环境的影响。除了由LRP-1 调控的信号通路外，其他信号通路也能参与到血管生成中，例如，LRP-1 的NPxY 模体（与同β 1-整合素的相互作用有关）基因缺失突变后，小鼠的胚胎成纤维细胞或神经元细胞显示出了迁移能力的受损[30]。β1-整合素能通过调控VEGF信号传导、粘着斑的组装/分解以及细胞骨架重构过程在血管生成中起重要作用[31]，这说明LRP-1 也很有可能通过整合素信号传导通路来调节血管生成。在血管出芽过程中，尖端与茎中大量内皮细胞的形成，尖端细胞的迁移和茎细胞增殖等关键过程正在逐渐被研究清楚[32]。确认LRP-1 对这些过程是否有调控作用有很大的研究意义。内皮细胞的代谢，尤其是BFKBP驱动的糖酵解，在尖端细胞的增殖过程中起着关键的作用[33]。无论LRP-1这个脂质代谢调节因子对血管生成、出芽过程及内皮代谢的作用能否成为一个火热的研究课题，确认在不同血管生成模型及不同病理条件下各个信号通路的确切作用都是十分必要的。由于LRP-1 信号传导的复杂性，需要对其分子生物学检测和活体病生实验结果进行细致的分析，而这些研究将为设计以LRP-1为基础的血管生成相关疾病的治疗方案提供有益的帮助。