孤独症细胞模型应用研究进展

何雪玲，张应花

(新乡医学院基础医学院解剖学教研室 新乡市分子神经病学重点实验室，河南 新乡 453003)

孤独症是一种复杂、普遍的神经系统发育障碍性疾病，多在3岁前发病，其病因复杂，临床表型和遗传异质性明显。目前对孤独症的研究主要借助于动物模型和细胞模型。孤独症动物模型容易制作，但干扰因素较多，表型多样且造模周期长。孤独症体外细胞模型种类多样，比较常用的细胞系有肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞、人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞、原代神经元、淋巴细胞系及诱导的多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。孤独症细胞模型的建立能弥补动物模型的不足，具有可操作性强、周期短等优点，对阐明孤独症发病机制、发现药物作用新靶点、研发与筛选新药以及评价新药疗效有重要意义。本文就孤独症细胞模型的应用及其相关病理机制研究进展加以综述。

1 PC12细胞

肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞是1976年Greene和Tisehler从大鼠肾上腺髓质瘤中移植出的单克隆细胞株[1]，其在常规条件下可作为一种儿茶酚胺样细胞，具有增殖细胞的一些特性。PC12细胞可在神经生长因子诱导下增殖并分化为交感神经样细胞，其形态、生理及生物化学功能接近神经元。PC12细胞已作为一种研究神经发育的标准体外细胞模型广泛应用于帕金森病、阿尔茨海默症等神经系统疾病的研究。

孤独症是神经发育障碍性疾病，其发病机制与突触功能异常有关[2-3]，神经信号蛋白(neuroligins，NLGNs)通过与突触前、后神经元联系并介导信号的传导，参与神经网络的形成、可塑性及成熟[4]。NLGNs上的R451C基因可参与孤独症的发病[5]。ULBRICH等[6]利用NLGN3转染PC12 Tet-On细胞，并使用多西环素诱导PC12 Tet-On细胞过表达NLGN3，进行体外培养发现，R451C突变可引起NLGN3蛋白在细胞内质网内聚集，并导致氧化应激异常；且带有突变型R451C的PC12细胞的氧化应激标志物C/EBP同源蛋白、蛋白78含量高于野生型鼠来源的PC12细胞，这一结果与氧化应激参与孤独症的发病机制是一致的[7]。孤独症的发病机制复杂，影响因素多样，研究显示，人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome，PTEN)与多巴胺功能障碍和孤独症破坏性行为有关，PTEN基因缺失有利于多巴胺神经元的存活及功能恢复[8-9]，而多巴胺在调节运动、学习、行为、情绪和社会交往中起重要作用。HE等[10]研究显示，孤独症模型小鼠酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和多巴胺受体增加，导致磷酸化蛋白激酶B(phosphate protein kinase B，P-PKB)增加，推测孤独症的发生与磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)信号通路下游靶基因PTEN突变有关；利用Tet-On启动子处理PC12细胞，发现Tet-On PC12细胞中PTEN表达量低于野生型PC12细胞，TH、P-PKB、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(phosphatase cAMP-response element binding protein，P-CREB)均升高；PI3K抑制剂LY294002及血清饥饿处理后的PC12细胞中TH、P-PKB、P-CREB表达降低；提示孤独症发生过程中PTEN可通过抑制PI3K/CREB通路使TH表达降低，为治疗孤独症提供了针对PTEN-TH-多巴胺通路的靶向药物。

因PC12细胞具有较高的同质性，已广泛应用于神经细胞分化、离子通道、受体、递质分泌的各种研究中，PC12细胞模型为研究孤独症提供潜在的平台。由于PC12细胞是一种肿瘤细胞，经过多次传代，其形状和性状会发生改变，所以，在将PC12细胞模型应用于神经系统疾病发病机制和药物作用机制的研究时应慎重。

2 SH-SY5Y细胞

SH-SY5Y 细胞来源于人神经母细胞瘤株，具有类似神经元的形态和生理、生物化学特性，增殖迅速，可连续稳定传代，其神经外胚层谱系是适合研究神经发育过程中神经表型和神经退行性疾病的细胞模型[11]，且具有成本低、易于培养分化、再生性和重现性较好等优点，被广泛应用于神经系统疾病发病机制的研究[12]。

近年来，随着基因组分析技术的运用，研究者发现，孤独症患者血浆和脑脊液中存在多种microRNA表达异常[13]。脆性综合征为孤独症类型中的一种，包括miR-19b-3p在内的多种microRNA能调控脆性综合征相关基因[14]。为研究 miR-19b-3p与脆性综合征相关基因的关系，MA等[14]以SH-SY5Y细胞为模型进行研究发现，与转染NC mimic的SH-SY5Y细胞比较，转染 miR-19b-3p mimic的SH-SY5Y 细胞的靶基因RAB18、USP32表达上升，而靶基因FXR1、DUSP 表达下降，提示miR-19b-3p有望成为治疗孤独症的新靶点。另有研究显示，孤独症患者血浆和脑脊液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平增加，提示TNF-α可能是孤独症的生物标志物[15]。KALKAN等[16]利用TNF-α干预SH-SY5Y细胞，发现SH-SY5Y 细胞内caspase-3蛋白表达水平增加，引起神经元凋亡，进而导致神经元缺失，这一现象与孤独症动物模型大脑神经元缺失是一致的[2]，提示可以用TNF-α干预SH-SY5Y细胞以研究孤独症有关神经元缺失的发病机制。

SH-SY5Y细胞作为神经毒性模型可用于直观研究与疾病有关的突触异常及相关蛋白的表达，实验简便，可操作性及重复性较好，但也存在一些问题：首先，与其他细胞模型相比，SH-SY5Y细胞不能应用于观察神经发育过程[17]；其次，SH-SY5Y细胞在实验过程中不断增殖，数量不断增加，很难检测神经保护剂或神经毒性药物是否影响细胞增殖率或细胞死亡率[18]；最后，与原代神经元比较，未分化的SH-SY5Y细胞对神经毒素和神经保护剂的敏感性较小[19]。

3 原代神经元

原代神经元培养离体时间短，遗传性状与体内细胞相似，适用于神经元形态、功能和分化等研究。另外，原代神经元比多次传代的细胞更接近体内神经细胞的正常发育状态，且该细胞具有干扰因素少和结果易于观察等优点，因此，原代神经元体外培养成为研究神经系统疾病的常用方法。

Wnt/β-catenin信号通路参与调控个体发育早期阶段神经元增殖、分化、凋亡、迁移以及神经元形态和神经突触的形成与联系[20]。研究显示，丙戊酸钠(valproic acid，VPA)孤独症模型大鼠脑区Wnt/β-catenin 信号通路活化，而应用该通路的特异性抑制剂舒磷酸干预后其孤独症样行为得到改善，提示Wnt/β-catenin信号通路在孤独症的发生过程中起重要作用；同时发现，原代神经元经VPA 预处理后Wnt/β-catenin信号通路中关键信号分子β连环蛋白、磷酸化糖原合成酶激酶-3表达均上升，提示原代神经元内Wnt信号通路活化[21-22]。此外，孤独症患者体内存在内质网应激异常[7]，导致神经元成熟障碍。VPA干预的原代神经元能够较好地模拟孤独症患者内质网应激异常状态，并抑制原代细胞树突和轴突长度，从而影响神经元的发育成熟[23]。应用VPA预处理的原代神经元所建立的孤独症细胞模型，为进一步揭示孤独症患者脑区存在内质网应激异常的机制提供了研究平台。粘连蛋白突变可引起孤独症小鼠社会交互障碍[24]，提示粘连蛋白异常与孤独症发生有关联[25]。进一步利用原代细胞培养发现，粘连蛋白并不影响突触的数量，而是影响突触的抑制性和兴奋性功能[26]，提示粘连蛋白影响突触功能，进而引起社会交互障碍等孤独症行为异常，可能导致对孤独症易感性增加。

与体内试验相比，原代神经元培养具有简便快速、条件易控制、药理靶点与环节较为清晰等优点，其不足之处在于不能完全模拟在体环境，限制了原代神经元在神经系统疾病研究中的广泛应用。

4 淋巴细胞系

淋巴细胞亚群分析是检测细胞免疫和体液免疫功能的重要指标，总体反映机体当前的免疫功能、状态和水平，并可辅助诊断某些疾病如自身免疫性疾病、免疫缺陷病、神经系统疾病等，对研究发病机制、观察疗效及预后有重要意义。孤独症患者存在免疫系统异常[27]。丙酸 (propionic acid，PPA)是短链脂肪酸，能激活淋巴细胞系非典型性免疫，且对孤独症患者淋巴细胞系线粒体功能障碍有不同的调节作用[28]。FRYE 等[29]将孤独症患者的淋巴细胞暴露于不同浓度的PPA，发现1 mmol·L-1的PPA作用24、48 h能显著改善淋巴细胞系线粒体功能障碍，且能上调免疫系统活化相关的基因，特别是涉及免疫球蛋白产生的基因。PPA还能增加海马区胶质纤维酸性蛋白免疫活性及促进小胶质细胞和白细胞介素-6的活化[30]。ROSE等[31]利用男性孤独症患者淋巴细胞系进行研究发现，1 mmol·L-1的丁酸脂(butyrate，BT)能改变与线粒体裂变有关的磷酸酶及张力蛋白同源物诱导的蛋白激酶1、线粒体动力相关蛋白和生理应激有关的蛋白哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、解偶联蛋白2、缺氧诱导因子-1α，并能改变与认知和行为相关的基因CREB1、CamkinaseⅡ，表明BT在生理应激和(或)线粒体功能障碍的情况下可增强线粒体功能，改善疾病状态下的能量代谢。BT能治疗VPA引起的孤独症行为[31]，并对孤独症相关基因进行调控[32]，有望成为治疗孤独症的新药。

淋巴细胞是细胞遗传学及分子遗传学的主要研究材料，样本容易获取，但孤独症患者较分散，疾病的异质性明显，且淋巴细胞收集后不易保存，不能传代培养，常需反复采集患者的样品，再次取样较难，给疾病的深入研究带来困难。

5 iPSCs

iPSCs是日本科学家TAKAHASHI等[33]利用 Oct-4、Sox-2、Klf4、c-Myc等4个转录因子组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似于胚胎干细胞的一种细胞类型。近年来，国内外利用iPSCs已成功构建多种神经系统疾病细胞模型[34]，这些细胞模型带有捐赠者的基因特征，能够在体外表现出与体内病理特征相似的疾病特点。孤独症患者的外周单核细胞经过仙台病毒载体重编程为iPSCs，提供了较好的孤独症细胞模型，能更好地应用于研究其病理机制、药物治疗、基因治疗等[35]。

孤独症iPSCs细胞模型主要集中在祖细胞和神经元的表型上[36]。RUSSO等[37]成功地用孤独症患者的乳牙牙髓干细胞编程将其分化为神经元和星形胶质细胞，与正常人的乳牙牙髓干细胞分化的神经元和星形胶质细胞比较，孤独症细胞模型所表达的与突触有关的标志物神经突触素1、突触后致密蛋白95均减少，而神经元的标志物微管相关蛋白2表达无明显变化。孤独症患者来源的星形胶质细胞能产生较多的活性氧，体外培养96 h发现，细胞外谷氨酸含量增高，这与孤独症患者体内存在氧化应激异常以及谷氨酸含量增加是一致的[38]。星形胶质细胞异常能诱导孤独症的发生[39]。有研究将星形胶质细胞与神经元共培养，发现星形胶质细胞可使神经元的突触长度变短及突触相关蛋白表达减少，且星形胶质细胞可以促进神经元形态改变和突触形成，与孤独症患者脑组织中存在星形胶质细胞改变并能影响神经元的异常是一致的[40]。

尽管使用iPSCs建立疾病模型具有很好的发展前景，但探寻更理想的种子细胞仍然是孤独症干细胞治疗的重要课题。牙髓干细胞是来源于神经嵴的牙源性干细胞，相比于其他干细胞，其具有更加明显的神经分化潜能，而且可自体取材，免疫原性低，在治疗孤独症疾病方面更具有优势。但不足之处是，许多神经系统疾病使用iPSCs进行体外模拟时能从分子层面分析疾病相关蛋白的表达，但无法观察到典型的病理表型；另一方面，制备iPSCs所使用的核心转录因子之一c-Myc 已经被证明是癌基因，通过病毒转染的方法引入外源基因，基因片段会随机插入细胞基因组中，可能引发细胞癌变，因此，用iPSCs开展孤独症相关研究时应该严格控制其致瘤风险。

6 总结和展望

由于PC12细胞、SH-SY5Y细胞、原代神经元、外周淋巴细胞系及iPSCs用于孤独症相关研究时各有利弊，限制了孤独症体外模型的广泛应用。但随着外显子测序技术的发展，研究者利用CRISPR /Cas技术已成功建立了灵长类孤独症细胞模型，其细胞模型无论是形态上还是功能上都较接近人类细胞，对孤独症发病机制的研究将起到重要的推进作用[41]。由于道德观念的约束，孤独症患者的标本难以得到，成功建立灵长类来源的孤独症细胞模型，对阐明孤独症发病机制及发现特异性标志物、药物作用靶点、研发与筛选新药以及评价新药疗效有重要意义。