Numb与阿尔茨海默病

王亚莉，原 翔，吴婉柳，王 璐，翟德胜，5，赵 营，6，王萌萌，王建刚，路承彪

(1.河南省无创性神经调制国际联合实验室，河南 新乡 453003；2.新乡医学院基础医学院生理学教研室，河南 新乡 453003；3.河南科技大学第一附属医院河南省肿瘤表观遗传重点实验室，河南 洛阳 471003；4.河南中医药大学呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南 郑州 450000；5.新乡医学院公共卫生学院流行病学教研室，河南 新乡 453003；6.新乡医学院药学院新乡市临床精神药理学重点实验室，河南 新乡 453003)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种严重的神经退行性疾病，主要表现为记忆力减退和认知能力下降。神经突触丢失、β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉积形成老年斑、细胞内高度磷酸化的tau蛋白形成神经纤维缠结是其主要病理学特征，AD病理生理过程还涉及神经再生调控[1-2]。AD发病机制的核心是淀粉样前体蛋白(amyloid precusor protein，APP)异常加工，APP蛋白水解模式主要有2种：(1)通过α和γ分泌酶途径产生非淀粉样蛋白，释放出胞外的可溶性淀粉样前体蛋白-α(soluble amyloid precursor protein-α，sAPP-α) 对神经元产生保护作用；(2)通过β和γ分泌酶的顺序作用，产生Aβ肽，Aβ沉积形成老年斑促进AD的发生。

Numb起初被描述为果蝇感觉器官发育过程中的细胞表型决定因子，是一种单次跨膜蛋白，存在4种不同的亚型，都含有磷酸酪氨酸结合结构域(phosphotyrosine binding domain，PTB)及脯氨酸富含区结构域(proline rich region，PRR)，但结构的长度不同。长PTB域(long phosphotyrosine binding domain，LPTB)或者短PTB域(short phosphotyrosine binding domain，SPTB)分别指含有或者缺乏11个氨基酸插入；长PRR域(long proline-rich region，LPRR)或短PRR域(short proline-rich region，SPRR)指含有或者缺乏48个氨基酸插入。Numb和Numb-like是人类2个同源基因。Numb位于14q23，由13个外显子组成，通过剪接产生至少9种不同的转录物[2]。Numb外显子6交替剪接产生不同的Numb亚型，外显子6编码Numb PTB结构域中的11个氨基酸序列。Numb的模块化结构决定了其可作为分子连接蛋白，与激酶、内吞蛋白、黏附分子及泛素连接酶相互作用，发挥多种生理作用[3]。Numb诱导细胞分化的重要机制之一是Numb PTB域与Numb伴侣分子(partner of numb，PON)特异性结合，产生不均匀分布，含有结合体的子细胞，在不对称分裂过程中抑制Notch信号并启动子细胞分化[3]。

Numb亚细胞的定位受到G蛋白偶联受体和激酶包括钙调蛋白依赖性蛋白激酶及非典型蛋白激酶C(atypical protein kinase C，aPKC)的调节[3]。Numb的降解是通过与Numb蛋白X家族E3泛素连接酶的配体(ligand of NUMB protein-X，LNX)[4]及Mdm2[5]的泛素结合，靶向转运到蛋白酶体进行的。

1 Numb在成熟神经元中的表达与降解

Numb不仅维持神经干细胞和神经元的发育，在成熟神经元中也有表达。有条件地敲除小脑浦肯野细胞中的Numb基因，将导致运动、学习功能障碍和细胞内mGlu1的转运异常[6]。在小鼠前脑背侧的谷氨酸能神经元中有条件地敲除Numb及其Numb-like同源基因，小鼠将表现出明显的焦虑样行为。因此，谷氨酸能神经元中的Numb/Numb样蛋白缺失会引起焦虑样反应[7]。

LNX可靶向调节Numb的蛋白酶体降解，有研究显示，LNX 1/LNX 2双基因敲除小鼠表现出焦虑相关行为的减少，而LNX单基因缺失的小鼠无Numb功能障碍，无学习、运动或感觉功能异常[4]。

2 Numb与神经元分化和突触形成

Numb 具有在2个子细胞之间不对称分布的潜力，从而使它们能够选择不同的细胞表型，充当二元开关，对神经系统发育过程中的不对称分裂至关重要。PC12细胞中过表达SPTB可诱导明显的神经元样分化，而过表达LPTB Numb则诱导细胞增殖[8]。有研究表明，交替pre-mRNA剪接是产生基因产物多样性的主要机制之一。体外培养的皮层神经元突起的生长需要RNA结合基序4(RNA-binding motif 4，RBM4)，RBM4可通过调节组织特异性的pre-mRNA剪接调控细胞分化；还可通过调节Numb外显子的选择，促进神经元分化和突起生长。缺乏RBM4的胚胎小鼠大脑表现出Numb pre-mRNA的异常剪接与神经元突起生长缺陷，这种缺陷可被外显子9-缺乏的Numb亚型修复[9]。神经元特异性RNA结合蛋白Rbfox3，是作用于Numb pre-mRNA编码的1个信号适配蛋白，可以促进神经元的分化。研究显示，表达Numb剪接亚型，能改善Rbfox3缺失引起的神经元分化缺陷，Rbfox3依赖的Numb交替剪接，在神经元分化过程中起着重要作用[10]。

AD患者树突棘的减少程度与疾病进展高度相关，且新突触的形成是记忆和认知的关键[1]。Numb可以影响突触的形成，海马神经元中的LPTB/LPRR Numb亚型过表达可导致神经元突触棘长度增加。Cdc42、Rac和Rho均是Rho家族三磷鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)酶的成员，Numb可与CDC42鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchang factor,GEF)、Rac GEF Tiam1和Rho GEF Kalirin相互作用，GEF通过GTP与二磷鸟苷(guanosine diphosphate，GDP)交换激活Rho蛋白，通过调节肌动蛋白而在突触形成中起关键作用。另外，Numb可与N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)谷氨酸受体和EphB2相互作用[11]，EphB2是突触正常活动所必需，而EphB2在AD大脑中表达下调[12]。

3 Numb与APP转运

APP异常加工产生Aβ是AD发病的核心机制。APP及分泌酶转运失调可显著影响APP的加工。另外，AD患者神经元存在内吞功能受损，内吞小体增大是内吞功能受损的早期病理学表现。由于α分泌酶主要位于细胞膜，而β分泌酶位于酸性细胞内区室如内吞小体，因此，APP细胞内转运在Aβ形成中起主要作用。

Numb是一种网格蛋白相关分选蛋白(clathrin associated sorting protein，CLASP)，可识别[FY] xNPx[YF]基序(x为任何氨基酸)[13]，介导了网格蛋白调节的内吞作用。ADP核糖体化因子6(ADP ribosylation factor 6，Arf6)是GTP结合蛋白家族成员，参与非网格蛋白依赖的蛋白转运。Numb在Arf6信号调节的蛋白内吞过程中起作用[3]。

Numb羧基末端区域含保守的序列，包括天门冬氨酸(D)-脯氨酸(P)-苯丙氨酸(F)(DPF)和天门冬酰胺(N)-脯氨酸(P)-苯丙氨酸(F)(NPF)基序。DPF基序是网格蛋白相关的α-适配蛋白的结合位点[13]，而NPF基序与含有表皮生长因子受体通路底物15同源性结构域的蛋白相互作用，因此在功能上，Numb也是一个内吞适配蛋白。

在稳定转染不同Numb亚型的细胞中表达SPTB Numb，细胞表现出异常APP积累，而表达LPTB Numb的细胞则表现出APP减少。表达SPTB Numb和LPTB Numb的细胞中β和γ分泌酶的活性及APP mRNA的表达量比较差异均无统计学意义，提示Numb通过改变APP的细胞内转运影响APP的代谢[14]。AD患者大脑存在极性蛋白Par3缺失。Par3缺失导致α分泌酶对APP降解的下降，APP靶向转运至内吞小体/溶酶体，产生Aβ积累。Par3过表达可促进非淀粉途径的APP加工。Par3通过干扰Numb和APP的相互作用而发挥作用[14]。另有实验表明，携带APP瑞典双突变K595N /M596L的SH-SY5Y细胞过表达SPTB Numb，增加了Aβ的产生，而过表达LPTB Numb降低了Aβ的产生，因此，不同Numb亚型差异性影响APP转运[14]。在撤出营养因子引起的应激条件下，也观察到Numb从LPTB切换到SPTB，促进了Aβ的生成。AD小鼠(3xTg)大脑和AD患者顶叶皮质存在SPTB Numb亚型表达增加，表明Numb亚型的变化在AD发病过程中起着一定的作用[15]。

4 Numb与细胞信号通路

AD患者多种神经功能如突触可塑性及神经再生严重受损，而Notch信号通路可以调节突触可塑性[16]及神经再生[17]。Notch 1和2受体与APP存在直接相互作用[18]。与APP类似，Notch受体是α和γ分泌酶的底物，这种蛋白水解过程是信号传导的先决条件。γ分泌酶抑制剂治疗AD可导致Notch信号受损[19]。Numb与Notch信号通路密切相关，各Numb亚型对Notch信号传导的作用也不同[20]。LPTB/SPRR Numb通过招募E3泛素连接酶Itch而促进Notch 1的泛素化[21]。γ分泌酶裂解APP 羧基末端部分结合Numb并抑制Notch[22]。

AD患者神经元存在钙离子失衡[23]。过表达SPTB Numb的PC12细胞诱导神经突起生长不需要NGF，但依赖于电压依赖性钙通道的激活[7-8]，这些细胞及培养的皮质神经元更容易受到Aβ毒性的影响。此外，Aβ处理培养皮质神经元可上调SPTB Numb亚型表达，提示内源性Numb在AD相关的神经元死亡过程中起作用[15]。稳定高表达SPTB Numb亚型的PC 12细胞表现出较高的Notch活性与Notch依赖性瞬时受体电位通道6(transient receptor potential channel 6，TRPC6) 转录。从培养基中撤出营养因子后，TRPC6上调导致钙失调和细胞死亡增加[24]。基因敲除TRPC6或Notch通路，减轻撤出营养因子诱导的Numb所致细胞死亡，TRPC6的差异表达与钙信号的紊乱及撤出营养因子所致神经元死亡的易感性增加相关，提示Numb参与AD神经元钙失衡调控。此外，Numb与细胞周期调节蛋白Polo样激酶1相互作用(polo-like kinase 1,PLK1)。AD患者的PLK1活性升高，PLK1沉默可减少Aβ诱导的神经细胞死亡[25]。

另外，Numb在神经营养因子信号传导中可以促进神经元存活。研究表明，海马神经元中的TrkA和TrkB内吞作用需要Numb结合伴侣及表皮生长因子受体通路底物15同源性结构域的参与[26]。

5 Numb与神经再生

齿状回的颗粒下区和脑室下区存在神经再生，脑室下区神经再生在人类出生18个月后大部分停止，而AD患者的神经再生能力发生改变。有实验表明，Numb对于神经上皮细胞架构维护至关重要，Numb可通过调节Notch信号传导在神经再生中起作用[17]。Numb蛋白缺失严重影响室管膜完整性和脑室下区的稳态[27]。

6 小结

体外实验数据显示，Numb影响神经元分化与生长。在体实验证据表明，SPTB Numb亚型在AD小鼠模型和人类个体中都有增加。而Numb在AD发病过程中的病理生理机制尚需要进一步实验来证明。对AD小鼠的特异性Numb亚型的靶向干预将为揭示Numb在AD中的作用提供独特的视野。Numb作为潜在药物靶标或生物标志物的临床意义仍有待未来的研究来证明。然而，进一步阐明Numb与APP相互作用的生理相关性，可以更全面地了解AD的发病机制。