Bacillus subtilisS21产抗菌脂肽分离鉴定及半固态发酵工艺初探

■田秋月 刘 杰 张 亮 胡美忠

（铜仁职业技术学院，贵州铜仁554300）

养殖业中抗生素滥用带来抗生素残留、耐药菌出现等公共卫生问题，迫切需要寻找新的药物来替代抗生素在养殖业中的应用。Surfactin和Fengycin是芽孢杆菌属产生的脂肽。Surfactin是由七个氨基酸和β羟基脂肪酸链组成的环状脂肽[1]，具有广谱高效抗菌[2]、抗病毒活性[3]，对支原体和原虫有显著的抑制效果[4]，对畜禽具有很好的促生长、抗氧化、抗菌、增强机体免疫力及改善肉质品质等作用[5-6]，是一种潜在的新型绿色抑菌促生长饲料添加剂。Fengycin呈环状结构，由β羟基脂肪酸链和十个氨基酸残基构成，具有良好的抗丝状真菌活性，可用来防治丝状真菌污染[7]。

芽孢杆菌产生的抗菌脂肽Surfactin和Fengycin有区别于传统抗生素的抗菌机制，不易产生耐药性，且对耐药菌株有良好的抑制效果[8]，在动物生产中具有替代抗生素的潜力，近年来受到关注，如都海明等[9]研究了枯草芽孢杆菌fmbj产抗菌脂肽对肉鸡生产性能及免疫机能的影响，结果表明添加4 000 U/kg抗菌脂肽能促进肉鸡的生长发育和提升免疫机能。翟少伟等[10]实验了不同抗菌脂肽添加物对吉富罗非鱼增重、血清生化指标的影响，结果表明抗菌脂肽添加物可提升吉富罗非鱼增重，有利于其血清生化指标。

本文分离鉴定了一株枯草芽孢杆菌产的抗菌物质，并对其产量提升做了优化，以期为促进安全、环保新型饲料添加剂的开发提供思路，实现我国畜牧业健康安全可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基及菌种

landy培养基：葡萄糖20 g、酵母粉1 g、磷酸二氢钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、L-谷氨酸0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸锰0.005 g、L-苯丙氨酸0.002 g、五水硫酸铜0.001 6 g、七水硫酸亚铁0.001 5 g、水1 L、pH值7。

LB培养基：胰蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母粉5 g、纯净水1 L，pH值7.2。

菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）S21，民族中兽药分离纯化技术国家地方联合工程研究中心中兽药微生物发酵研究室筛选鉴定，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 25923），购自 Ameri⁃can type culture collection。

1.1.2 主要仪器

超净工作台（ZHJH-C1214C，上海智城）；安捷伦1100型液相色谱仪；安捷伦G6400液质联用仪；高压灭菌锅（HVE-50，北方华粤）；pH计（DELTA 320，上海闵胜）；恒温培养箱（BPH-9042，上海一恒）。

1.2 方法

1.2.1B.subtilisS21产抗菌脂肽发酵生产及初步分离

吸取微量-70℃保藏的B.subtilisS21菌液，转置于LB培养基，37℃过夜培养至菌长出，接种环沾取微量菌液于LB固体培养基划线培养，待长出菌落，挑取长势良好的单菌落接种于landy培养基，37℃培养12 h作为种子液，种子液按1%（v/v）接种于landy培养基，180 r/min，37 ℃培养36 h，得发酵液。用3 mol/l HCl调节发酵液pH值至2，搅拌均匀后，静置于4℃下12 h后，8 000×g离心得沉淀，沉淀加入原发酵液0.5倍体积甲醇（调节pH值至7），磁力搅拌10 min，8 000×g离心得上清液，重复甲醇萃取沉淀一次，合并甲醇萃取液，旋转蒸干，残渣用少量蒸馏水溶解，得粗抗菌脂肽提取物。

1.2.2B.subtilisS21产抗菌脂肽纯化

粗抗菌脂肽初提物使用LH-20进一步分离纯化，洗脱液为纯甲醇，流速1 ml/5 min，以金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）做为指示菌，采用琼脂扩散法（制备带金黄色葡萄球菌平板，5 mm打孔器打孔，孔中加入洗脱液80 μl，37℃下培养24 h后测量抑菌圈直径）检测各管洗脱液的活性，得抗菌脂肽精提物。

1.2.3 抗菌脂肽鉴定

抗菌脂肽精提物使用安捷伦1100型液相色谱HPLC检测，色谱条件：色谱柱5 TC-C18；波长210 nm；流速1 ml/min；时间0～20 min；90%乙腈-90%乙腈(有机相和水相均含0.1%三氟乙酸)。使用安捷伦G6400三重四极杆质谱联用仪进行质谱鉴定，根据质谱图推断其结构。

1.2.4B.subtilisS21产Surfactin非无菌半固态发酵初探

前期探索性实验发现，利用黄豆作为主要培养基质，采用半固态发酵方式，B.subtilisS21产Surfactin产量比使用landy培养基高出50～100余倍。经过查阅文献，结合实验过程中的经验发现，是否添加碳源（从葡萄糖、麦芽糖、淀粉、蔗糖四种碳源中选择最佳的葡萄糖）和无机盐体系（七水硫酸镁0.5 g/l、氯化钾0.5 g/l、硫酸锰0.005 g/l、五水硫酸铜 0.001 6 g/l、七水硫酸亚铁0.001 5 g/l，选自landy培养基的无机盐体系）对Surfactin产量影响极为明显；另外，发酵时间和温度对Surfactin产量也有影响，故采用Minitab软件设计四因素三水平正交实验筛选B.subtilisS21产Sur⁃factin的半固体发酵最佳方法，因素水平见表1。

表1B.subtilisS21半固体发酵培养因素水平

Surfactin液相检测色谱方法：色谱柱5 TC-C18；波长210 nm；流速1 ml/min；时间：0～20 min；90%乙腈-90%乙腈(有机相和水相均含0.1%三氟乙酸)。同色谱条件下检测精密配制的Surfactin（sigma）标准品梯度溶液含量，制作Surfactin标准品浓度与峰面积关系的标准曲线。

半固体发酵流程为：市售黄豆，粉碎成粗颗粒(1粒黄豆裂成约2～4片)，冷水盖住黄豆浸泡12 h后蒸熟，趁热把黄豆颗粒盛入用开水淋洗的带盖托盘，黄豆厚度约2～3 cm，待冷却后，接入黄豆重量5%（v/g）的B.subtilisS21种子液，同时按表1所示的比例加入葡萄糖和无机盐体系。

待发酵完成，使用甲醇萃取发酵的黄豆2～3次，合并萃取液，高效液相色谱法检测甲醇萃取液中Sur⁃factin的峰面积，根据标准曲线计算其含量。

2 结果与分析

2.1 B.subtilisS21产抗菌脂肽的纯化鉴定

2.1.1 Surfactin鉴定

抗菌脂肽精提物高效液相色谱HPLC检测，得到图1所示峰。从图1可以看出，此抗菌脂肽提取物出现四个峰，保留时间与标准品Surfactin保留时间一致，初步判定此四个峰为Surfactin同系物。

图1B.subtilisS21产抗菌脂肽高效液相色谱图（A）及与Surfactin标准品对照图（B）

B.subtilisS21产抗菌脂肽质谱鉴定结果见图2，由图2可知，出现了994.5、1 008.5、1 022.6、1 036.5四个＜M+H＞离子峰，之间相隔分子量为14，即CH2-，且分子量与Surfactin同系物一致，进一步判断为Surfac⁃tin同系物。

选择液相图中保留时间靠后的三个峰进一步进行质谱分析，结果见图3（A,B,C），从图3（A）可知，出现了＜M+H＞为1 008.9的加 H 离子峰，＜M+Na＞为1 030.7的加Na离子峰，从图3（B）可知，出现了＜MCH2+H＞为 1 022.6的 H 离子峰，＜M-CH2+Na＞为1 044.5的加Na离子峰，从图3（C）可知，出现了＜MCH2-CH2+H＞为1 036.5的H离子峰，＜M-CH2-CH2+Na＞为1 058.3的加Na离子峰。对1 008.5、1 022.6、1 036.5进行二级质谱鉴定，结果见图3(a,b,c)，根据二级质谱裂解碎片及文献资料[11-13]，可以推断出此抗菌脂肽结构为：β-OH-C13-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu（Ile）。分别计算对应分子量1 007、1 021、1 035。其中第七位Leu还有可能为Ile，具体是哪一个氨基酸残基有待进一步分析，推断过程见图3a、b、c所示。

一级质谱中出现的994加H离子峰，根据Surfac⁃tin同系物相差CH2-的特性，推断其结构为β-OHC12-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu（Ile）。

综合所得，B.subtilisS21产Surfactin的四种同系物为：β-OH-C12-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu（Ile）。

2.1.2 Fengycin鉴定

在对B.subtilisS21产粗抗菌脂肽的抑菌谱实验中发现（数据未列出），B.subtilisS21产粗抗菌脂肽对黑曲霉表现出抑制活性，证明B.subtilisS21产抗菌脂肽除了Surfactin（不具备霉菌抑制活性）外，还产生其他抗菌脂肽。在使用LH-20纯化的某一管洗脱液质谱鉴定过程中（见图4），出现了＜M+H＞为1 462.9的加H离子峰，＜M+Na＞为1 484.1的加Na离子峰，＜M-CH2+H＞为1 476.9加H离子峰，＜M-CH2+H＞为1 499.6的加Na离子峰，＜M-CH2-CH2+H＞为1 490.9加H离子峰，＜M-CH2-CH2+H＞为1 513.6的加Na离子峰，对＜M+H＞为1 476.9进行二级质谱，可以发现出现了1 109和995的加氢碎片离子，而1 108和994是Fengycin B的特征性片段[14-15]，故推断此抗菌脂肽为Fengycin B（C14-16）,氨基酸残基序列为 Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Gln-Tyr-Ile。

2.2 B.subtilisS21产Surfactin非无菌半固态发酵初探

2.2.1 Surfactin标准曲线

采用液相色谱测定，得到了Surfactin标准品峰面积与浓度（mg/ml）的关系函数。

图2B.subtilisS21产抗菌脂肽一级质谱图

图3B.subtilisS21产Surfactin鉴定流程

式中：y——峰面积；

x——浓度。

2.2.2 非无菌半固态发酵配方

采用Minitab软件设计四因素三水平正交实验，B.subtilisS21产Surfactin非无菌半固态发酵实验设计及结果见表2。

从表2可以看出，影响B.subtilisS21产Surfactin的因子为D（发酵温度）＞B（葡萄糖）＞C（发酵时间）＞A（无机盐体系）。根据均值效应，可以得出此发酵条件下B.subtilisS21产Surfactin最佳的方法为A3B2C3D2，即无机盐体系添加20%，葡萄糖添加5%，发酵时间48 h，发酵温度37℃，验证实验表明此条件下Surfac⁃tin产量可达到4.02 mg/g，比原始landy培养基的产量22.1 mg/l(为B.subtilisS21菌株在landy培养基中Sur⁃factin的产量)增加了180余倍（landy培养基1 L按黄豆1 kg计）。

3 讨论

芽孢杆菌产生的抗菌脂肽基于其抗菌抗病毒功效及安全无毒的特性，在医药、食品等领域有广阔的应用前景，特别是在当今寻找动物生产中抗生素替代品领域具有很大潜力。芽孢杆菌产生的常见抗菌脂肽多种多样，有Surfactin、Fengycin、iturin等[16-17]，抗菌脂肽有不同的同系物，不同的抗菌脂肽及同种抗菌脂肽的同系物其作用功效有区别，故为了科学利用芽孢杆菌产生的抗菌脂肽，就有必要弄清其结构[18]。芽孢杆菌产抗菌脂肽成熟的鉴定方法为质谱法，利用抗菌脂肽的特征碎片离子峰可以快速鉴定出其结构。

图4B.subtilisS21产Fengycin鉴定过程

Surfactin典型结构为不同长度的β羟基脂肪酸链（一般为C13-15）和Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu通过内酯键连接而成的环状结构，其断裂片段为特征离子峰，β羟基脂肪酸链链长和七肽的氨基酸残基组成在不同芽孢杆菌产生的Surfactin有可能不同，故Surfactin存在许多同系物，但主要存在两种类型，即7位上的氨基酸是Leu或Val。Fengycin典型结构为不同长度的β-羟基脂肪酸链（一般为C14-18）和Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala(Val)-Pro-Gln-Tyr-Ile组成环状结构，主要有Fengycin A和Fengycin B两种，当肽链的6位上是Ala时，属于Fengycin A；而当肽链的6位上是Val时，属于Fengycin B[19]，在质谱鉴定上，主要看其裂解的特征离子峰，Fengycin A会出现1 080和966的特征峰，Fengycin B则会出现1 108和994的特征峰。

表2B.subtilisS21产Surfactin正交实验设计

虽然Surfactin在医药、食品等领域有广阔的应用前景，但是目前最大的问题是Surfactin产量低，且存在分离纯化成本高的问题。目前Surfactin生产主要通过液态发酵生产，但是产量极低，野生株型产量达到30 mg/l已经是高产，且发酵过程会遇到发泡，液态发酵分离纯化难等问题[20]，故针对芽孢杆菌代谢特点，利用半固态发酵可以杜绝发泡难题，且半固体发酵节省了固液（水）分离步骤，可直接使用有机溶剂固液萃取，解决了液态发酵分离纯化难等难题，另外利用优势菌群的原理，在非严格无菌状态下可以完成发酵，能大量节省(如严格灭菌)成本。Surfactin产量上，一是利用诱变和分子生物学手段对菌种进行改造，二是筛选能大幅度影响Surfactin产量的关键培养基质，通过这两种方法，Surfactin产量可以比野生菌株提高数百倍，本文利用关键培养基质黄豆，可轻易提升Surfactin产量百余倍。